应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 实时荧光定量 相对定量 标准曲线的问题
111/2返回列表12下一页
查看: 3133  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量 相对定量 标准曲线的问题

各位同仁：
    我最近做相对定量，首先做标准曲线看内参和目的基因的扩增效率是否一致，在这个环节上一直无法突破。
    问题是：我的cDNA以10倍梯度稀释了13个梯度，但是Ct值都很接近，都在19-21之间。我的体系是takela的，20ul
mix10
上0.4
下0.4
模板1
水8.2

95° 30s
95°5s
60°30s   40个循环

用的是96孔板，先把mix和上下，水混匀分装后，再加模板。
mix用之前先颠倒混匀。
加样时避免气泡的产生。

我的cDNA是由天根的反转录试剂盒得来的，用5ug的总RNA反转录成50ul的体系。

请各位帮我分析一下原因吧！做了3周了，一直这样无进展，很苦闷！谢谢您的分享和帮助了~
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-03-21 00:30:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
求助啊求助！
回复此楼
2楼2013-03-21 12:53:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

phhcrab

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
桃之夭夭pFly: 金币+10 2013-03-21 17:31:58
你是10倍稀释的么？怎么会稀释了13个梯度，Ct都差不多呢？没稀释好吧，或者有污染。
赞一下 回复此楼
3楼2013-03-21 13:37:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bunnyxia

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 14:45:25
起始的ct值不高，可以用PCR产物试试。稀释梯度一般6、7个就行，可以5倍或10倍稀释。稀释时最好10ul稀释到100ul，而且要混匀，不要相互污染。
赞一下 回复此楼
4楼2013-03-21 17:09:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by phhcrab at 2013-03-21 13:37:10
你是10倍稀释的么？怎么会稀释了13个梯度，Ct都差不多呢？没稀释好吧，或者有污染。

我是吸1ul加9ul的水，吸打混匀后再吸1ul到另一个pcr管中，加9ul水，如此重复做的~‘
是不是扩大成10ul加90ul的水这样稀释比较好？
你说的污染指的是哪一步怎么污染的呢？
谢谢你的回复~
赞一下 回复此楼
5楼2013-03-21 17:29:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bunnyxia at 2013-03-21 17:09:12
起始的ct值不高，可以用PCR产物试试。稀释梯度一般6、7个就行，可以5倍或10倍稀释。稀释时最好10ul稀释到100ul，而且要混匀，不要相互污染。

pcr产物？意思是用普通pcr扩增我的目的基因后，再作为模板稀释？
那我标准曲线这样得出，我做相对定量的时候也要这样吗》？
谢谢你的回复~
赞一下 回复此楼
6楼2013-03-21 17:31:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我反正-信了

木虫 (小有名气)
我也一直在做这个，我用的也是TAKARA的，稀释的梯度没这么多，我是6个，外加三个重复和一个空白，也是10倍稀释，但是按10——100ul来稀释的反应条件中我40Cycies中有三步：95 5s，58  31s，72  30s：其他都差不多，试剂也一样！
赞一下 回复此楼
7楼2013-03-22 09:31:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangqian082

新虫 (小有名气)
你提的RNA有没有去基因组污染呢
而且你做的时候改用八连管试一下，加样顺序：水>sybr green>引物>模板
试一下吧
赞一下 回复此楼
8楼2013-03-22 12:08:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

phhcrab

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 桃之夭夭pFly at 2013-03-21 17:29:48
我是吸1ul加9ul的水，吸打混匀后再吸1ul到另一个pcr管中，加9ul水，如此重复做的~‘
是不是扩大成10ul加90ul的水这样稀释比较好？
你说的污染指的是哪一步怎么污染的呢？
谢谢你的回复~...

确实10ul加到90ul里会好很多的，混匀可以在涡旋振荡器上晃一下，然后离心。反复吹打会增加挂壁的，更何况才10ul。

未必是污染造成的，但是污染在哪一步都可能发生的。比如实验环境、移液器、枪头等等都可能存在污染的，如果你的样品体系很小的话，一点污染造成的影响可能就很大了。

做定量最好是用带滤芯的枪头，如果没这条件的话，那操作要更小心点。
赞一下 回复此楼
9楼2013-03-26 11:36:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by phhcrab at 2013-03-26 11:36:40
确实10ul加到90ul里会好很多的，混匀可以在涡旋振荡器上晃一下，然后离心。反复吹打会增加挂壁的，更何况才10ul。

未必是污染造成的，但是污染在哪一步都可能发生的。比如实验环境、移液器、枪头等等都可能存在 ...

好的~谢谢了！近期发现是引物的退火温度的问题，提高到65°就好很多了~
赞一下 回复此楼
10楼2013-03-27 10:00:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 桃之夭夭pFly 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 机械学硕310分，数一英一，一志愿211本科双非找调剂信息 +3 @357 2026-03-25 3/150 2026-03-26 16:34 by by.MENG
[考研] 北科281学硕材料求调剂 +17 tcxiaoxx 2026-03-20 19/950 2026-03-26 16:04 by 不吃魚的貓
[考研] 材料学硕297已过四六级求调剂推荐 +13 adaie 2026-03-19 13/650 2026-03-26 14:05 by 小小麦片
[考研] 一志愿南航 335分 | 0856材料化工 | GPA 4.07 | 有科研经历 +6 cccchenso 2026-03-23 6/300 2026-03-25 22:25 by 544594351
[考研] 0854AI CV方向招收调剂 +4 章小鱼567 2026-03-23 4/200 2026-03-25 17:04 by CoderLoser
[考研] 材料学硕，求调剂 6+4 糖葫芦888ll 2026-03-22 9/450 2026-03-25 11:19 by greychen00
[考研] 考研化学308分求调剂 +10 你好明天你好 2026-03-23 11/550 2026-03-25 10:23 by userper
[考研] 07化学280分求调剂 +7 722865 2026-03-23 7/350 2026-03-25 09:29 by aa331100
[考研] 289材料与化工（085600）B区求调剂 +4 这么名字咋样 2026-03-22 5/250 2026-03-25 08:20 by mx.yue
[考研] 材料学求调剂 +6 Stella_Yao 2026-03-20 6/300 2026-03-25 00:37 by baoball
[考研] 化工专硕求调剂 +3 question挽风 2026-03-24 3/150 2026-03-24 18:48 by jhhcooi
[考研] 材料292调剂 +8 橘颂思美人 2026-03-23 8/400 2026-03-24 16:33 by laoshidan
[考研] 085404电子信息284分求调剂 +4 13659058978 2026-03-24 4/200 2026-03-24 12:15 by syl20081243
[考研] 284求调剂 +3 yanzhixue111 2026-03-23 6/300 2026-03-23 22:58 by pswait
[考研] 336求调剂 +4 收到VS 2026-03-20 4/200 2026-03-23 19:02 by macy2011
[考研] 336化工调剂 +4 王大坦1 2026-03-23 5/250 2026-03-23 18:32 by allen-yin
[考研] 求调剂一志愿海大，0703化学学硕304分，有大创项目，四级已过 +6 幸运哩哩 2026-03-22 10/500 2026-03-22 20:10 by edmund7
[考研] 308求调剂 +3 墨墨漠 2026-03-21 3/150 2026-03-22 16:54 by i_cooler
[考研] 生物学调剂 +5 Surekei 2026-03-21 5/250 2026-03-22 14:39 by tcx007
[考研] 一志愿西安交通大学 学硕 354求调剂211或者双一流 +3 我想要读研究生 2026-03-20 3/150 2026-03-20 20:13 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭