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实时荧光定量 相对定量 标准曲线的问题
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各位同仁： 我最近做相对定量，首先做标准曲线看内参和目的基因的扩增效率是否一致，在这个环节上一直无法突破。 问题是：我的cDNA以10倍梯度稀释了13个梯度，但是Ct值都很接近，都在19-21之间。我的体系是takela的，20ul mix10 上0.4 下0.4 模板1 水8.2 95° 30s 95°5s 60°30s 40个循环 用的是96孔板，先把mix和上下，水混匀分装后，再加模板。 mix用之前先颠倒混匀。 加样时避免气泡的产生。 我的cDNA是由天根的反转录试剂盒得来的，用5ug的总RNA反转录成50ul的体系。 请各位帮我分析一下原因吧！做了3周了，一直这样无进展，很苦闷！谢谢您的分享和帮助了~ |
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