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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 最近两次的荧光定量溶解曲线 有多个峰
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涛哥哥

银虫 (初入文坛)

[交流] 最近两次的荧光定量溶解曲线 有多个峰

还请各位指出其中错误可能的原因
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1楼 2012-07-26 11:44:16
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gy313wyn

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
涛哥哥(金币+1): 谢谢参与
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-26 21:58:17
由于几个基因的条带比较杂乱，可能共有的原因是
（1）引物特异性不好。如果是在文献中查找的，要到NCBI里进行比对看是不是目的基因的引物序列，要注意选择影响因子较高的文章中的引物可信性较高。
（2）如果引物没啥问题，那就看退火温度。可以采用普通PCR设置不同温度梯度进行扩增后跑琼脂糖电泳看哪个温度下有条带，确定基本合适的温度
（3）RNA模板可能也有问题，看看测浓度是OD值是多少，反转录后DNA模板浓度多少，进行定量时添加量也要适当
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2楼2012-07-26 20:05:09
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涛哥哥

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gy313wyn at 2012-07-26 20:05:09
由于几个基因的条带比较杂乱，可能共有的原因是
（1）引物特异性不好。如果是在文献中查找的，要到NCBI里进行比对看是不是目的基因的引物序列，要注意选择影响因子较高的文章中的引物可信性较高。
（2）如果引物没 ...

我用这些引物做多态都很好的  持家基因以前也有师兄做过  
RNA模板的OD值确实很多不在正常范围  反转录后的浓度2000左右  我的图就是转录后的DNA按十倍梯度稀释后的相对标准曲线   请问您的反应体系cDNA添加量是多少啊？
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3楼2012-07-27 11:01:40
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gy313wyn

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 涛哥哥 at 2012-07-27 11:01:40
我用这些引物做多态都很好的  持家基因以前也有师兄做过  
RNA模板的OD值确实很多不在正常范围  反转录后的浓度2000左右  我的图就是转录后的DNA按十倍梯度稀释后的相对标准曲线   请问您的反应体系cDNA添加量是多 ...

RNA OD260/280还是要在2左右为好
我用的机子是7300的机子  10ul体系加1ul模板 模板浓度200~300
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4楼2012-07-27 14:33:24
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涛哥哥

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gy313wyn at 2012-07-27 14:33:24
RNA OD260/280还是要在2左右为好
我用的机子是7300的机子  10ul体系加1ul模板 模板浓度200~300...

是体系里的模板终浓度吗？ 我用的机子是7500
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5楼2012-07-27 16:47:18
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gy313wyn

铜虫 (小有名气)
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6楼2012-07-27 18:59:00
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涛哥哥

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gy313wyn at 2012-07-27 18:59:00
两个机子可能还是会有差异的。不是终浓度，是200~300的加了1ul...

我正在摸条件 模板换成DNA溶解曲线也是有多个峰
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7楼2012-07-27 23:28:43
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gy313wyn

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 涛哥哥 at 2012-07-27 23:28:43
我正在摸条件 模板换成DNA溶解曲线也是有多个峰...

先跑普通PCR摸退火温度吧
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8楼2012-07-28 14:35:34
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涛哥哥

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gy313wyn at 2012-07-28 14:35:34
先跑普通PCR摸退火温度吧...

您说的普通PCR是用7500跑还是用普通PCR仪做   我的目的基因退火温度以前做多态时摸过啊
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9楼2012-07-28 16:25:51
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jl860822

金虫 (正式写手)
★
涛哥哥(金币+1): 谢谢参与
建议在ＤＮＡ水平上做个预实验确定一下退火温度，这对于后续的实时定量是很有帮助的
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10楼2012-07-28 21:22:53
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涛哥哥

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-28 21:22:53
建议在ＤＮＡ水平上做个预实验确定一下退火温度，这对于后续的实时定量是很有帮助的

我前段时间一直做这个  跑的图就是在最适退火温度下做的啊
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11楼2012-07-28 21:39:57
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