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RT—PCR引物、条带问题，新手求助，求意见，求建议！
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小弟新手做RT—PCR不久，从RNA的提取到RT—PCR遇到了一系列问题，有些知道原因有些甚是不解，所以到这里求大侠们帮助。先看我的图吧，这是我RT—PCR后跑得电泳图，此图为不同引物扩增的结果，maker使用的D2000，最后一个泳道是GAPDH、倒数第二个为UBQ，其他目的条带都在200bp左右，体系（25ul）用的是12.5ul的mix、2ul的模版（大概有3000ng）、引物各1ul（10μmol/L）。跑出这个图我也不知道怎么评价不过就是觉得和我师姐做的差很多她用的和我一样的引物体系跑出的结果很漂亮见黑白图。所以我也不晓得什么原因，RNA我是用ctab法提的，质量在1.8以上，跑胶可以看到轻微的DNA污染，很淡。不过反转录后质量只有1.6左右（反转录用的是宝生物用于做荧光定量的反转录试剂盒）。以上是我试验的过程我讲的这么详细就是想大家帮我指出具体什么地方做的不规范有问题，帮我指出来，先谢谢了，要毕业了实验还没做完着急啊，大侠们都快点现身吧！ clip_image002.jpg  2.jpg |
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2楼2012-12-26 21:17:02
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【答案】应助回帖
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首先，胶肯定没有制好，所以marker也不漂亮。 其次，RNA中已经确定有DNA污染了最好再做DNase消化，不能直接做反转录。即使是真核样品，cDNA与基因组DNA模板P出的条带大小不同，也最好完全除去DNA再做反转。否则有模板竞争问题，对半定量来说不会很好。而且有DNA的RNA样品定量是不准确的。 再有，反转录后的cDNA没必要再做什么定量了，因为样品中有RNA模板和cDNA，定也是不准确的。一般是把RNA除去DNA后定量，然后用1ug/20ul去反转，然后再稀释样品5-10倍后用1ul去PCR。 最后就是PCR条件最好优化一下。虽然觉得你的模板量是有问题的，3000ng也太夸张了，直接可以跑电泳都可以看到了。 |
3楼2012-12-27 01:37:54
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