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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT—PCR引物、条带问题，新手求助，求意见，求建议！
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wl554520877

铁虫 (初入文坛)

[求助] RT—PCR引物、条带问题，新手求助，求意见，求建议！

小弟新手做RT—PCR不久，从RNA的提取到RT—PCR遇到了一系列问题，有些知道原因有些甚是不解，所以到这里求大侠们帮助。先看我的图吧，这是我RT—PCR后跑得电泳图，此图为不同引物扩增的结果，maker使用的D2000，最后一个泳道是GAPDH、倒数第二个为UBQ，其他目的条带都在200bp左右，体系（25ul）用的是12.5ul的mix、2ul的模版（大概有3000ng）、引物各1ul（10μmol/L）。跑出这个图我也不知道怎么评价不过就是觉得和我师姐做的差很多她用的和我一样的引物体系跑出的结果很漂亮见黑白图。所以我也不晓得什么原因，RNA我是用ctab法提的，质量在1.8以上，跑胶可以看到轻微的DNA污染，很淡。不过反转录后质量只有1.6左右（反转录用的是宝生物用于做荧光定量的反转录试剂盒）。以上是我试验的过程我讲的这么详细就是想大家帮我指出具体什么地方做的不规范有问题，帮我指出来，先谢谢了，要毕业了实验还没做完着急啊，大侠们都快点现身吧！

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只为毕业！没出息吧，呵呵~~
1楼 2012-12-26 20:58:26
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1 胶制的不好，marker条带都拖尾。而且扫胶的时候焦距没调准，发虚，其实条带还可以，光圈调小一点的话条带边上的模糊就不会有，PCR产物的上样量也可以小一些。
2 我觉得PCR体系模板高了，具体体系和退火温度的优化你可以请教你师姐，能节省你的时间和精力。
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2楼2012-12-26 21:17:02
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先，胶肯定没有制好，所以marker也不漂亮。
其次，RNA中已经确定有DNA污染了最好再做DNase消化，不能直接做反转录。即使是真核样品，cDNA与基因组DNA模板P出的条带大小不同，也最好完全除去DNA再做反转。否则有模板竞争问题，对半定量来说不会很好。而且有DNA的RNA样品定量是不准确的。
再有，反转录后的cDNA没必要再做什么定量了，因为样品中有RNA模板和cDNA，定也是不准确的。一般是把RNA除去DNA后定量，然后用1ug/20ul去反转，然后再稀释样品5-10倍后用1ul去PCR。
最后就是PCR条件最好优化一下。虽然觉得你的模板量是有问题的，3000ng也太夸张了，直接可以跑电泳都可以看到了。
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3楼2012-12-27 01:37:54
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wl554520877

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ccharlien at 2012-12-26 21:17:02
1 胶制的不好，marker条带都拖尾。而且扫胶的时候焦距没调准，发虚，其实条带还可以，光圈调小一点的话条带边上的模糊就不会有，PCR产物的上样量也可以小一些。
2 我觉得PCR体系模板高了，具体体系和退火温度的优化 ...

首先先谢谢你朋友，制胶我也发现问题的，是我自己没摇匀，另外每个泳道前沿的那些模糊条带是不是引物二具体呢，通过优化体系和退火温度是不是可以去除，还有就是第二个泳道靠近胶空位置的那个条带是什么原因造成的，是因为dna有污染么？还请您帮我分析下
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4楼2012-12-27 16:01:58
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wl554520877

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-27 01:37:54
首先，胶肯定没有制好，所以marker也不漂亮。
其次，RNA中已经确定有DNA污染了最好再做DNase消化，不能直接做反转录。即使是真核样品，cDNA与基因组DNA模板P出的条带大小不同，也最好完全除去DNA再做反转。否则有模 ...

谢谢你，那是不是说引物是没问题的呢？
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5楼2012-12-27 16:03:53
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by wl554520877 at 2012-12-27 16:01:58
首先先谢谢你朋友，制胶我也发现问题的，是我自己没摇匀，另外每个泳道前沿的那些模糊条带是不是引物二具体呢，通过优化体系和退火温度是不是可以去除，还有就是第二个泳道靠近胶空位置的那个条带是什么原因造成的 ...

是二聚体，体系优化后可以变得很淡
那条带有可能是基因组扩增的带，你可以看看你那对引物在基因组上扩增的话片段是那么大么？也有可能只是非特异性扩增，你可以调整退火温度来解决
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6楼2012-12-27 17:40:33
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wl554520877

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ccharlien at 2012-12-27 17:40:33
是二聚体，体系优化后可以变得很淡
那条带有可能是基因组扩增的带，你可以看看你那对引物在基因组上扩增的话片段是那么大么？也有可能只是非特异性扩增，你可以调整退火温度来解决...

好的谢谢你我先试试！有问题再来请教你！
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7楼2012-12-27 18:27:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by wl554520877 at 2012-12-27 16:03:53
谢谢你，那是不是说引物是没问题的呢？...

引物也有些问题。下面靠近前沿的大概是引物二聚体，很亮。这样的引物做定量时扩增效率肯定不行。你可以优化PCR条件，寻找最优退火温度，降低引物浓度（从原来的0.4uM降到0.2-0.25uM）。不过，如果引物设计本身就不好的话很难完全除去引物二聚体的，只能从新设计引物了。
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8楼2012-12-28 05:03:34
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wl554520877

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-28 05:03:34
引物也有些问题。下面靠近前沿的大概是引物二聚体，很亮。这样的引物做定量时扩增效率肯定不行。你可以优化PCR条件，寻找最优退火温度，降低引物浓度（从原来的0.4uM降到0.2-0.25uM）。不过，如果引物设计本身就不 ...

引物是通过https://www.genscript.com这个网站设计的，每个基因他给了几对引物我也不懂的怎么筛选，求解啊
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9楼2012-12-28 09:09:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by wl554520877 at 2012-12-28 09:09:43
引物是通过https://www.genscript.com这个网站设计的，每个基因他给了几对引物我也不懂的怎么筛选，求解啊...

首先你要确定引物的特异性。尤其是有基因家族的，看是否是特异扩增你要的基因。此外，你需要分析引物是否形成稳定的二级结构，引物是否形成同源二聚体，是否形成异源二聚体。如果想做定量的话，对引物的要求比较高，不能有稳定的次级结构形成。如果是online program的话，设计引物的时候你可以自己修改一些参数。
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10楼2012-12-28 09:47:57
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