| 查看: 2429 | 回复: 9 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
RT—PCR引物、条带问题，新手求助，求意见，求建议！
|
||
小弟新手做RT—PCR不久，从RNA的提取到RT—PCR遇到了一系列问题，有些知道原因有些甚是不解，所以到这里求大侠们帮助。先看我的图吧，这是我RT—PCR后跑得电泳图，此图为不同引物扩增的结果，maker使用的D2000，最后一个泳道是GAPDH、倒数第二个为UBQ，其他目的条带都在200bp左右，体系（25ul）用的是12.5ul的mix、2ul的模版（大概有3000ng）、引物各1ul（10μmol/L）。跑出这个图我也不知道怎么评价不过就是觉得和我师姐做的差很多她用的和我一样的引物体系跑出的结果很漂亮见黑白图。所以我也不晓得什么原因，RNA我是用ctab法提的，质量在1.8以上，跑胶可以看到轻微的DNA污染，很淡。不过反转录后质量只有1.6左右（反转录用的是宝生物用于做荧光定量的反转录试剂盒）。以上是我试验的过程我讲的这么详细就是想大家帮我指出具体什么地方做的不规范有问题，帮我指出来，先谢谢了，要毕业了实验还没做完着急啊，大侠们都快点现身吧！ clip_image002.jpg  2.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有137人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- RT-PCR引物稀释问题，欢迎战友们进来指导！急盼中
已经有16人回复
- 最近RT-PCR能够出来内参，却没有目的条带，请各位高手帮忙
已经有9人回复
- RT-PCR没有出现内参基因的条带和目的条带，请问是什么原因？
已经有11人回复
- 大家做RT-qPCR设计引物用的什么软件呀？
已经有15人回复
- 土壤DNA提取，真菌通用引物PCR，琼脂糖电泳图，感觉有问题，新手求助
已经有7人回复
- RT-PCR时GAPDH能跑出来，但目的条带跑不出来~~
已经有7人回复
- 求助！关于RT-PCR的问题！
已经有20人回复
- 向RTPCR高手求助，关于RTPCR的空白对照问题
已经有9人回复
- ＲＴ－ＰＣＲ问题求助
已经有18人回复
- 【求助/交流】是PCR条件不对还是引物的原因？（附电泳图）
已经有16人回复
- 【求助】pcr引物退火温度
已经有9人回复
- 【求助/交流】荧光定量PCR与半定量的RT－PCR在设计引物时有什么区别？
已经有8人回复
- 【求助/交流】RT-PCR ，内参在哪个步骤添加以及marker何时使用及确定？谢谢
已经有14人回复
- 【求助/交流】做培养细胞的RT-PCR，β-actin内参出现两个条带，求原因。
已经有10人回复
- 【求助/交流】PCR引物二聚体问题
已经有11人回复
- 【求助/交流】pcr反应目的条带很浅，引物二聚体很亮
已经有33人回复
- 【求助/交流】引物Tm值很高，PCR求助
已经有17人回复
- 【求助/交流】细菌V3区PCR出现问题，引物为357和518，用于DGGE！
已经有8人回复
- 【求助/交流】RT-PCR不成功
已经有25人回复
- 【求助/交流】PCR引物设计出来了，但酶切之后电泳没条带啊
已经有18人回复
- 【求助/交流】RT-PCR总是得不到目的条带
已经有12人回复
- 【求助/交流】Real time RT-PCR 引物设计问题（高悬赏请高手帮忙）
已经有28人回复
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
8楼2012-12-28 05:03:34
ccharlien
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 82 (初中生)
- 金币: 2630.1
- 红花: 3
- 帖子: 334
- 在线: 180.3小时
- 虫号: 1168776
- 注册: 2010-12-13
- 性别: GG
2楼2012-12-26 21:17:02
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
|
首先，胶肯定没有制好，所以marker也不漂亮。 其次，RNA中已经确定有DNA污染了最好再做DNase消化，不能直接做反转录。即使是真核样品，cDNA与基因组DNA模板P出的条带大小不同，也最好完全除去DNA再做反转。否则有模板竞争问题，对半定量来说不会很好。而且有DNA的RNA样品定量是不准确的。 再有，反转录后的cDNA没必要再做什么定量了，因为样品中有RNA模板和cDNA，定也是不准确的。一般是把RNA除去DNA后定量，然后用1ug/20ul去反转，然后再稀释样品5-10倍后用1ul去PCR。 最后就是PCR条件最好优化一下。虽然觉得你的模板量是有问题的，3000ng也太夸张了，直接可以跑电泳都可以看到了。 |
3楼2012-12-27 01:37:54
4楼2012-12-27 16:01:58
