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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR引物稀释问题，欢迎战友们进来指导！急盼中
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2011加油

银虫 (正式写手)

[交流] RT-PCR引物稀释问题，欢迎战友们进来指导！急盼中

大家好，我的引物是交给英骏公司合成，之前没进行过引物稀释，大家帮忙看看我将这样配制是否正确，我需要的引物终浓度为10umol/L。以其中一管引物为例：nmols per OD=4.4，每管为1OD，离心后，先加入10ul DEPC水稀释成100umol/L母液，混匀，再取出100ul母液加入900ulDEPC水，混匀，即得10umol/L溶液。

另外，稀释的溶液说法不一，有用灭菌后的超纯水、TE溶液、DEPC水，是不是进行RT-PCR实验，采用DEPC水更好一些？？

最后，英骏公司的DNA合成说明书背面，我有一些看不明白，给出这个信息
Scale of Synthesis:100nmole想说明的是什么哦？？
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1楼 2012-11-01 19:48:36
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回帖置顶 ( 共有1个 )

静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
2011加油: 金币+2, 是的，谢谢交流，是按照后面更正的来计算不？盼回复 2012-11-01 21:42:44
2011加油: 回帖置顶 2012-11-02 14:40:07
是开始加44ul depc水形成母液的吧
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4楼2012-11-01 20:22:15
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普通回帖

2011加油

银虫 (正式写手)
有点错误了，需要更正一下，第一步先加44ul DEPC水，形成母液100umol/L。
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2楼2012-11-01 19:50:25
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2011加油

银虫 (正式写手)
再去10ul母液加入90ul DEPC水，混匀，即得。
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3楼2012-11-01 19:54:29
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gbone80

禁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
2011加油: 金币+2, 谢谢指导，能再回答一下说明书背面的100nmol是什么意思不？我确实没看明白 2012-11-01 21:43:47
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-02 13:56:07
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永峰1230
5楼2012-11-01 20:41:36
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as023

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
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2011加油: 金币+2, 谢谢交流啊 2012-11-02 08:18:32
用灭菌的二级水溶解即可
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7楼2012-11-01 21:52:00
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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
2011加油: 金币+2, 呵呵，谢谢，那我明白了，每管有多少nmol，就先加入它10倍量的DEPC水变成母液。 2012-11-02 08:20:16
引用回帖:
4楼: Originally posted by 静安jingan at 2012-11-01 20:22:15
是开始加44ul depc水形成母液的吧

是啊，我也是刚和师兄学习的嘿嘿
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8楼2012-11-01 22:18:10
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flyde1234

木虫 (正式写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-02 13:56:21
2011加油: 金币+2, 恩，好的，谢谢指导。祝实验顺利 2012-11-02 14:41:36
楼主，稀释用水用二级水灭菌就可以了，如果没有用纯净水灭菌也可以，我们实验室是做过实验的发现它们之间对实验结果没什么影响。稀释的话你直接稀释成10uM就可以了，不用那么麻烦。
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9楼2012-11-02 10:48:13
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小丑鱼663

金虫 (小有名气)
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2011加油: 金币+2, 哈哈，我明白 2012-11-02 14:42:21
我也是他们 家的,都跑出来了.你稀释的根我不一样.我分两次稀释,第一次按管上的标志数*10倍稀释,之后在10倍稀释.
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10楼2012-11-02 11:52:16
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小丑鱼663

金虫 (小有名气)
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2011加油: 金币+1, 呵呵，是的，谢谢指出错误，我在下面的第二条和第三条发言中更正了。 2012-11-02 14:37:58
感觉你第一步就弄错了,呵呵,你做参考阿,提个建议.
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11楼2012-11-02 11:54:49
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2011加油

银虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 小丑鱼663 at 2012-11-02 11:54:49
感觉你第一步就弄错了,呵呵,你做参考阿,提个建议.

我在后面又更正了，你再帮我看看，对不？
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13楼2012-11-02 14:36:50
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mutou1025

铜虫 (小有名气)
★ ★
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2011加油: 金币+1, 哈哈，引物终浓度是多少哦？ 2012-11-02 17:37:26
做RT 引物浓度不能太高，要不溶解曲线上就会看到二聚体的曲线了。我做20ul 引物一般加0.6ul
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14楼2012-11-02 15:14:24
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caoxin1984

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
稀释引物的溶液确实好多，灭菌后的超纯水、TE溶液、DEPC水均可，对后续进行RT-PCR实验影响不大。
但有报道显示，引物在偏酸性的溶液中易降解（超纯水很多偏酸性），采用偏碱性的TE溶液对于引物的长期保存会更好一些
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15楼2012-11-02 17:17:17
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2011加油

银虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by caoxin1984 at 2012-11-02 17:17:17
稀释引物的溶液确实好多，灭菌后的超纯水、TE溶液、DEPC水均可，对后续进行RT-PCR实验影响不大。
但有报道显示，引物在偏酸性的溶液中易降解（超纯水很多偏酸性），采用偏碱性的TE溶液对于引物的长期保存会更好一些

恩 这个我也了解了一下
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16楼2012-11-02 21:24:15
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永峰1230

铜虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
5楼: Originally posted by gbone80 at 2012-11-01 20:41:36
PCR引物的储存浓度是100umol，按合成说明书上写明的加入DEPC水即得，然后取部分再稀释10倍，即10umol。在最终体系里面浓度是1umol。

请问，，如果OD是2.5     nmol 12.5
125 buffer for 100 mM
如何配制呢，，，与OD有关系吗
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17楼2013-10-25 13:31:56
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2011加油6楼
2012-11-01 21:43   回复  
bob198712楼
2012-11-02 12:00   回复  
2011加油: 金币+1, 谢谢顶贴 2012-11-02 14:38:07
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