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兰朵

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助！荧光定量PCR标准曲线制作至少要几个梯度

请问大家在做荧光定量PCR的标准曲线时，至少需要稀释几个梯度？一般在多少个梯度较好？还有怎么看扩增效率呢？谢谢！最近在做这方面的，做标准曲线时，做了6个梯度，感觉只有4个做标曲比较好，准备就用这4个梯度的标曲来用，不知道可以不以
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1楼 2013-05-18 21:48:57
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niil

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
兰朵(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-20 08:27:13
做标准曲线至少要5个梯度才好，梯度越多获得的标准曲线越可靠。你的实验，做了六个梯度，自己感觉两个不好四个好，这种想法太主观，至少要尊重实验的结果。总得说起来六个梯度做出来的结果不符合标准的话，那说明你的实验体系还是有问题的，还需要再调整。
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Stop fighting,let it flow.
2楼2013-05-18 23:36:26
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兰朵

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by niil at 2013-05-18 23:36:26
做标准曲线至少要5个梯度才好，梯度越多获得的标准曲线越可靠。你的实验，做了六个梯度，自己感觉两个不好四个好，这种想法太主观，至少要尊重实验的结果。总得说起来六个梯度做出来的结果不符合标准的话，那说明你 ...

两点可以定一条直线，为什么做标准曲线只是要5条呢？4条不是已经是2条的2倍了吗？
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3楼2013-05-20 16:25:58
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兰朵

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by niil at 2013-05-18 23:36:26
做标准曲线至少要5个梯度才好，梯度越多获得的标准曲线越可靠。你的实验，做了六个梯度，自己感觉两个不好四个好，这种想法太主观，至少要尊重实验的结果。总得说起来六个梯度做出来的结果不符合标准的话，那说明你 ...

谢谢niil，请问若真的是试验体系的问题，需要从哪方面调整呢？
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4楼2013-05-20 16:36:17
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niil

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 兰朵 at 2013-05-20 16:36:17
谢谢niil，请问若真的是试验体系的问题，需要从哪方面调整呢？...

假若引物没有问题的话，能调整的一方面是引物浓度，另一方面是模板稀释的梯度的选择，初试模板太浓了或者太稀了都不佳。另外还要注意的是操作，平行样品之间尽量缩小差异。
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Stop fighting,let it flow.
5楼2013-05-20 19:56:47
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兰朵

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by niil at 2013-05-20 19:56:47
假若引物没有问题的话，能调整的一方面是引物浓度，另一方面是模板稀释的梯度的选择，初试模板太浓了或者太稀了都不佳。另外还要注意的是操作，平行样品之间尽量缩小差异。...

做标曲时，最麻烦的就是加样不准确，同一次稀释的样本，一会跑的就很好但多跑几次的结果都不一样，真心的累啊，一会相关系数好了，但是斜率又稍高了，不知道相关系数为1.0000、斜率为3.52时可不可以用
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6楼2013-05-24 11:25:15
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doglet

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

一般情况下做5个稀释度，每个稀释度做5个平行样，做出的标准曲线最后只要R2>=0.95就可以，并算出最低检出拷贝数，而且在你的接受范围就可以了。一般10倍稀释的话，每个浓度的ct值之差大致为3，且每一浓度的5个平行样之间的变异系数可以接受就行，然后重复3次，就差不多了。再做标准曲线时，一定要注意样品稀释的手法，每次配制液体的手法，要不可能差很多
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7楼2013-11-13 14:51:12
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