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兰朵

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助!荧光定量PCR标准曲线制作至少要几个梯度

请问大家在做荧光定量PCR的标准曲线时,至少需要稀释几个梯度?一般在多少个梯度较好?还有怎么看扩增效率呢?谢谢!最近在做这方面的,做标准曲线时,做了6个梯度,感觉只有4个做标曲比较好,准备就用这4个梯度的标曲来用,不知道可以不以
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niil

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
兰朵(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-05-20 08:27:13
做标准曲线至少要5个梯度才好,梯度越多获得的标准曲线越可靠。你的实验,做了六个梯度,自己感觉两个不好四个好,这种想法太主观,至少要尊重实验的结果。总得说起来六个梯度做出来的结果不符合标准的话,那说明你的实验体系还是有问题的,还需要再调整。
Stop fighting,let it flow.
2楼2013-05-18 23:36:26
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兰朵

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by niil at 2013-05-18 23:36:26
做标准曲线至少要5个梯度才好,梯度越多获得的标准曲线越可靠。你的实验,做了六个梯度,自己感觉两个不好四个好,这种想法太主观,至少要尊重实验的结果。总得说起来六个梯度做出来的结果不符合标准的话,那说明你 ...

两点可以定一条直线,为什么做标准曲线只是要5条呢?4条不是已经是2条的2倍了吗?
3楼2013-05-20 16:25:58
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兰朵

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by niil at 2013-05-18 23:36:26
做标准曲线至少要5个梯度才好,梯度越多获得的标准曲线越可靠。你的实验,做了六个梯度,自己感觉两个不好四个好,这种想法太主观,至少要尊重实验的结果。总得说起来六个梯度做出来的结果不符合标准的话,那说明你 ...

谢谢niil,请问若真的是试验体系的问题,需要从哪方面调整呢?
4楼2013-05-20 16:36:17
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niil

金虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 兰朵 at 2013-05-20 16:36:17
谢谢niil,请问若真的是试验体系的问题,需要从哪方面调整呢?...

假若引物没有问题的话,能调整的一方面是引物浓度,另一方面是模板稀释的梯度的选择,初试模板太浓了或者太稀了都不佳。另外还要注意的是操作,平行样品之间尽量缩小差异。
Stop fighting,let it flow.
5楼2013-05-20 19:56:47
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兰朵

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by niil at 2013-05-20 19:56:47
假若引物没有问题的话,能调整的一方面是引物浓度,另一方面是模板稀释的梯度的选择,初试模板太浓了或者太稀了都不佳。另外还要注意的是操作,平行样品之间尽量缩小差异。...

做标曲时,最麻烦的就是加样不准确,同一次稀释的样本,一会跑的就很好但多跑几次的结果都不一样,真心的累啊,一会相关系数好了,但是斜率又稍高了,不知道相关系数为1.0000、斜率为3.52时可不可以用
6楼2013-05-24 11:25:15
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doglet

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

一般情况下做5个稀释度,每个稀释度做5个平行样,做出的标准曲线最后只要R2>=0.95就可以,并算出最低检出拷贝数,而且在你的接受范围就可以了。一般10倍稀释的话,每个浓度的ct值之差大致为3,且每一浓度的5个平行样之间的变异系数可以接受就行,然后重复3次,就差不多了。再做标准曲线时,一定要注意样品稀释的手法,每次配制液体的手法,要不可能差很多
7楼2013-11-13 14:51:12
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