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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于实时荧光定量引物设计
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ttxs99

木虫 (小有名气)

[求助] 关于实时荧光定量引物设计

关于实时荧光定量引物设计，看有的资料说是要夸内含子，那我可不可以直接用CDS呢，或者一个外显子比较大，我在这个外显子里扩呢？
另外，假如以上都木有好的结果，可不可以在该基因的3'非翻译区设计呢，如果不行的话，又是什么原因呢？
跪求各路大侠帮忙释疑解难？
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淡定
1楼 2013-01-21 09:31:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2013-01-21 20:19:30
引物设计能跨内含子的最好，这样定量时以cDNA为模板P出的产物与基因组DNA模板P出的片段不同。真核生物成熟的mRNA包括5’cap-5'UTR-CDS-3'UTR-polyA。所以可以直接从CDS做。从一个外显子设计引物也是可以的。当然也是可以从非翻译区设计。
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ttxs99
2楼2013-01-21 10:12:00
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ttxs99

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-21 10:12:00
引物设计能跨内含子的最好，这样定量时以cDNA为模板P出的产物与基因组DNA模板P出的片段不同。真核生物成熟的mRNA包括5’cap-5'UTR-CDS-3'UTR-polyA。所以可以直接从CDS做。从一个外显子设计引物也是可以的。当然也是 ...

大侠，谢谢你的热心解答哦~~~~不过我有些地方还是不太明白~~~~如果在非翻译区设计引物，例如在3'UTR设计的引物，可以用基因组DNA为模板扩出来么？如果可以，那如何判断扩出来的片段是该基因反转录的结果呢？
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淡定
3楼2013-01-21 12:27:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by ttxs99 at 2013-01-21 12:27:46
大侠，谢谢你的热心解答哦~~~~不过我有些地方还是不太明白~~~~如果在非翻译区设计引物，例如在3'UTR设计的引物，可以用基因组DNA为模板扩出来么？如果可以，那如何判断扩出来的片段是该基因反转录的结果呢？...

RNA样品做反转录前是要用DNase消化掉DNA的，所以反转录后体系中只有RNA和cDNA。RNA不能被DNA聚合酶扩增，扩增出来的就是以cDNA为模板的产物。做反转录时需要做一个负对照，就是无逆转录酶的反转录体系，理论上这个样品是不会有扩增的。如果出现扩增，说明RNA样品中有残留基因组DNA。
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ttxs99
4楼2013-01-21 15:03:17
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ttxs99

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-21 15:03:17
RNA样品做反转录前是要用DNase消化掉DNA的，所以反转录后体系中只有RNA和cDNA。RNA不能被DNA聚合酶扩增，扩增出来的就是以cDNA为模板的产物。做反转录时需要做一个负对照，就是无逆转录酶的反转录体系，理论上这个 ...

假如我们把定量引物设计在3'utr，刚好模板中混有基因组DNA，由于部分引物结合到了基因组DNA中，所以最终会影响定量结果的。
但是，如果用DNase处理RNA之后或者夸内含子设计引物就不怕了影响结果，我说的对不对呢，cicelyzh？？
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淡定
5楼2013-01-21 19:27:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
ttxs99: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 谢谢你的耐心回复~~~~ 2013-01-22 11:12:43
引用回帖:
5楼: Originally posted by ttxs99 at 2013-01-21 19:27:33
假如我们把定量引物设计在3'utr，刚好模板中混有基因组DNA，由于部分引物结合到了基因组DNA中，所以最终会影响定量结果的。
但是，如果用DNase处理RNA之后或者夸内含子设计引物就不怕了影响结果，我说的对不对呢， ...

做定量的反转录前RNA样品都需要进行DNase消化的。消化掉基因组DNA这一步是非常重要的。否则即使扩增片段不同，DNA模板扩增出来的产物也是会生成荧光的，会影响定量结果。而且DNA模板也会竞争引物。只是，如果扩增片段大小不同，熔解曲线中会形成不同的peak，很容易从PCR结果看出样品是否存在痕量基因组DNA。所以，如果为了省钱，可以不用在逆转录时做我前面提到的负对照。如果没有夸内含子的话，这个负对照是必需做的。
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6楼2013-01-22 02:17:33
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