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ttxs99

木虫 (小有名气)

[求助] 关于实时荧光定量引物设计

关于实时荧光定量引物设计,看有的资料说是要夸内含子,那我可不可以直接用CDS呢,或者一个外显子比较大,我在这个外显子里扩呢?
另外,假如以上都木有好的结果,可不可以在该基因的3'非翻译区设计呢,如果不行的话,又是什么原因呢?
跪求各路大侠帮忙释疑解难?
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淡定
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ttxs99

木虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-21 15:03:17
RNA样品做反转录前是要用DNase消化掉DNA的,所以反转录后体系中只有RNA和cDNA。RNA不能被DNA聚合酶扩增,扩增出来的就是以cDNA为模板的产物。做反转录时需要做一个负对照,就是无逆转录酶的反转录体系,理论上这个 ...

假如我们把定量引物设计在3'utr,刚好模板中混有基因组DNA,由于部分引物结合到了基因组DNA中,所以最终会影响定量结果的。
但是,如果用DNase处理RNA之后或者夸内含子设计引物就不怕了影响结果,我说的对不对呢,cicelyzh??
淡定
5楼2013-01-21 19:27:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2013-01-21 20:19:30
引物设计能跨内含子的最好,这样定量时以cDNA为模板P出的产物与基因组DNA模板P出的片段不同。真核生物成熟的mRNA包括5’cap-5'UTR-CDS-3'UTR-polyA。所以可以直接从CDS做。从一个外显子设计引物也是可以的。当然也是可以从非翻译区设计。

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2楼2013-01-21 10:12:00
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ttxs99

木虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-21 10:12:00
引物设计能跨内含子的最好,这样定量时以cDNA为模板P出的产物与基因组DNA模板P出的片段不同。真核生物成熟的mRNA包括5’cap-5'UTR-CDS-3'UTR-polyA。所以可以直接从CDS做。从一个外显子设计引物也是可以的。当然也是 ...

大侠,谢谢你的热心解答哦~~~~不过我有些地方还是不太明白~~~~如果在非翻译区设计引物,例如在3'UTR设计的引物,可以用基因组DNA为模板扩出来么?如果可以,那如何判断扩出来的片段是该基因反转录的结果呢?
淡定
3楼2013-01-21 12:27:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by ttxs99 at 2013-01-21 12:27:46
大侠,谢谢你的热心解答哦~~~~不过我有些地方还是不太明白~~~~如果在非翻译区设计引物,例如在3'UTR设计的引物,可以用基因组DNA为模板扩出来么?如果可以,那如何判断扩出来的片段是该基因反转录的结果呢?...

RNA样品做反转录前是要用DNase消化掉DNA的,所以反转录后体系中只有RNA和cDNA。RNA不能被DNA聚合酶扩增,扩增出来的就是以cDNA为模板的产物。做反转录时需要做一个负对照,就是无逆转录酶的反转录体系,理论上这个样品是不会有扩增的。如果出现扩增,说明RNA样品中有残留基因组DNA。

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4楼2013-01-21 15:03:17
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