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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教PCR高手，使用SYBR Green I法进行荧光定量PCR对于产物大小有什么要求？
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by dayulee at 2012-12-03 11:34:30
你们设计荧光的引物是用什么软件设计啊

引物只要跨外显子设计就行了，其余的和普通的引物设计一样  设计的软件是Prime 5.0和 oligo 6.0   目的产物大小在100-200bp
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11楼2012-12-03 16:51:30
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dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫

【答案】应助回帖

谢谢楼主。我是使用的 Becon desigen软件设计的。你是做么确定引物是跨内含子的呢？ 请多多指点
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好好学习，天天向上
12楼2012-12-03 17:19:08
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by dayulee at 2012-12-03 17:19:08
谢谢楼主。我是使用的 Becon desigen软件设计的。你是做么确定引物是跨内含子的呢？ 请多多指点

设计的时候 是在外显子的连接处进行设计  这样子就避免了内含子的引入
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13楼2012-12-05 13:30:26
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by czcpudai at 2012-08-23 14:36:59
恩，非常感谢！我觉得您说的挺对的，只是引物要跨外显子设计，自己设计了一下但是没有找到合适的，要么特异性低，要么Tm值相差超过2度，还是仔细再找找吧...

如何才能跨外显子啊？怎么看外显子呢？
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14楼2013-04-01 22:40:28
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by czcpudai at 2012-12-03 16:51:30
引物只要跨外显子设计就行了，其余的和普通的引物设计一样  设计的软件是Prime 5.0和 oligo 6.0   目的产物大小在100-200bp...

请问如何跨外显子啊？本人新手！跨外显子设计是什么目的呢？
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15楼2013-04-01 22:41:26
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by czcpudai at 2012-12-05 13:30:26
设计的时候 是在外显子的连接处进行设计  这样子就避免了内含子的引入...

外显子的连接处是怎么看的啊？？？？？？、、、
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16楼2013-04-01 22:42:05
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by yuguiyan at 2013-04-01 22:42:05
外显子的连接处是怎么看的啊？？？？？？、、、...

到NCBI里面找到你的目的基因的编码区CDS，编码区里面是外显子集合的，然后你再在基因的全序列中找到外显子，这些外显子就按顺序拼合成CDS区~~~，拼接处，就是连接处
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17楼2013-04-02 13:48:52
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johnkm66

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-22 20:18:01
228可以试试。
我做过80-400bp的，200多点有的引物还是可以的，但是片段太长PCR效率就有点低，并且有非特异PEAK, 我一般用60度退火，但是提高温度到65度，可以减少或者消除非特异PEAK.
具体条件不能完全根据报道， ...

市面上的RT-qPCR试剂盒大多退火温度都在42度，能到50度及以上的极少，因为酶不支持。60度以上到65度实际是最好的，可以消除RNA的二级结构。SYBR Green I是非饱和染料，片段长度太长，荧光信号会出现偏差，不死扩不出来，而是荧光信号出现偏差后的错误信息。
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18楼2014-08-26 11:51:57
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摩天轮711

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

参照BIOG  SYBR最好是100bp-500bp，反应条件：95℃加热6-10分钟，以激活热启动DNA聚合酶，然后95℃ 5-15秒，60℃ 30-35秒，35个循环
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19楼2018-12-20 11:44:43
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摩天轮711

新虫 (初入文坛)
参照BIOG  SYBR最好是100bp-500bp，反应条件：95℃加热6-10分钟，以激活热启动DNA聚合酶，然后95℃ 5-15秒，60℃ 30-35秒，35个循环
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20楼2018-12-20 11:48:02
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