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heather-guo

新虫 (初入文坛)

[求助] SYBR荧光定量PCR检测病毒的表达量，模版的要求

本人是第一次做定量，有好多问题搞不懂，首先是模版，我见文章里有说提取RNA，反转录cDNA以后跑，而有的是提取DNA以后连接转化构建质粒，提取质粒DNA为模版，这是怎么回事。跑定量，对模版的浓度要求高吗，为稀释之前的初始浓度最低要求多少
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1楼 2013-07-15 15:56:01
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-07-18 14:14:50
荧光定量PCR是检测模板DNA分子拷贝数的方法。做反转录的目的是想用荧光定量的方法检测RNA的拷贝数，而RNA只有在反转录成cDNA后才能被DNA聚合酶识别并得到扩增。模板的浓度当然有一定限制，浓度太高或者太低会使扩增超出线性范围，一般CT数目在15-30比较合适。
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2楼2013-07-16 02:15:28
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普通回帖

heather-guo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-16 02:15:28
荧光定量PCR是检测模板DNA分子拷贝数的方法。做反转录的目的是想用荧光定量的方法检测RNA的拷贝数，而RNA只有在反转录成cDNA后才能被DNA聚合酶识别并得到扩增。模板的浓度当然有一定限制，浓度太高或者太低会使扩增 ...

我想通过荧光定量PCR检测病毒是否有增值，文章里提到提取RNA，反转录成CDNA跑定量，但我是DNA 病毒，为什么要提RNA 呢
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3楼2013-07-18 12:33:45
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wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
heather-guo(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-18 14:15:41
heather-guo: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-07-19 16:10:35
DNA病毒检测不需要逆转录。检测病毒是否有增值再具体一些呢？通常病毒检测都是绝对定量检测。需要已知浓度的标准品梯度稀释做标准曲线。
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4楼2013-07-18 12:41:12
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by heather-guo at 2013-07-18 12:33:45
我想通过荧光定量PCR检测病毒是否有增值，文章里提到提取RNA，反转录成CDNA跑定量，但我是DNA 病毒，为什么要提RNA 呢...

你可以去查一下，该病毒复制的时候是不是以RNA为中间体？如果是的话，PCR检测病毒是否有增值，提取RNA就不足为怪了！
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2013-07-18 14:16:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by heather-guo at 2013-07-18 12:33:45
我想通过荧光定量PCR检测病毒是否有增值，文章里提到提取RNA，反转录成CDNA跑定量，但我是DNA 病毒，为什么要提RNA 呢...

如果是DNA样品，当然不用做反转录了。一般DNA样品做绝对定量，就是确定样品中模板基因的拷贝数。
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6楼2013-07-19 01:01:12
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heather-guo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-19 01:01:12
如果是DNA样品，当然不用做反转录了。一般DNA样品做绝对定量，就是确定样品中模板基因的拷贝数。...

恩，对的，后来跟师姐讨论了一下，我是比较实验组之间的差异，做相对定量，直接用DNA 稀释去做标准曲线就可以啦
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7楼2013-07-19 16:09:56
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heather-guo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wangweida2 at 2013-07-18 12:41:12
DNA病毒检测不需要逆转录。检测病毒是否有增值再具体一些呢？通常病毒检测都是绝对定量检测。需要已知浓度的标准品梯度稀释做标准曲线。

恩，对的，后来跟师姐讨论了一下，我是比较实验组之间的差异，做相对定量，直接用DNA 稀释去做标准曲线就可以啦
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8楼2013-07-19 16:12:02
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heather-guo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-18 14:16:54
你可以去查一下，该病毒复制的时候是不是以RNA为中间体？如果是的话，PCR检测病毒是否有增值，提取RNA就不足为怪了！...

恩，知道了，谢谢你
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9楼2013-07-19 16:13:55
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晚安_旧时光

新虫 (初入文坛)
咨询一下,我想测我纯化的病毒的浓度,但是我的病毒并不能产生噬菌斑,所以想用实时定量PCR检测,具体该怎么进行呢``
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10楼2015-04-21 10:18:03
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