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czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] 请教PCR高手,使用SYBR Green I法进行荧光定量PCR对于产物大小有什么要求? 已有3人参与

本人打算做荧光定量PCR,现在做了普通的rt-pcr,三种基因的大小为352bp,362bp,228bp,结果都扩增出来了,下一步打算做荧光定量RT-PCR,荧光染料为SYBR,请问是不是可以接着使用普通Rt-PCR中所使用的引物呢,还是重新设计引物,使其产物大小在50-150bp之间???求解答??
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mutou1025

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-22 15:16:25
一般在100bp左右,重新设计引物。你的300多bp太大了。SYBR我记得程序变形退火时间 好像比普通PCR时间短。太大了会不会没有完全P出来啊
2楼2012-08-22 13:25:33
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ywding0628

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-22 15:16:34
一般都在80-150bp之间,建议重新设计引物。如果是SOSO FAST(BIORAD)的mix, 退火延伸一共只有5s。
性格埋下了人生的伏笔~
3楼2012-08-22 14:31:18
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助,七夕快乐 2012-08-23 15:55:31
228可以试试。
我做过80-400bp的,200多点有的引物还是可以的,但是片段太长PCR效率就有点低,并且有非特异PEAK, 我一般用60度退火,但是提高温度到65度,可以减少或者消除非特异PEAK.
具体条件不能完全根据报道,具体情况具体分析,不过个人觉得,100-200左右的就很好。如果你的228效果不好,可以试试重新设计引物把目标片段定于150bp左右。
4楼2012-08-22 20:18:01
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助,七夕快乐 2012-08-23 15:55:52
我用的条件是,
     95度 1分钟,
45 X  95度 15秒
     65度 (具体温度需要自己调整,我用的是65,他人可能一般用60度) 45秒
最后是MELT CUVE,
        95度   15秒
     65度   45秒
     95度   15秒
5楼2012-08-22 20:20:35
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by mutou1025 at 2012-08-22 13:25:33
一般在100bp左右,重新设计引物。你的300多bp太大了。SYBR我记得程序变形退火时间 好像比普通PCR时间短。太大了会不会没有完全P出来啊

哦 谢谢哈!
6楼2012-08-23 14:29:20
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-22 20:18:01
228可以试试。
我做过80-400bp的,200多点有的引物还是可以的,但是片段太长PCR效率就有点低,并且有非特异PEAK, 我一般用60度退火,但是提高温度到65度,可以减少或者消除非特异PEAK.
具体条件不能完全根据报道, ...

恩,非常感谢!我觉得您说的挺对的,只是引物要跨外显子设计,自己设计了一下但是没有找到合适的,要么特异性低,要么Tm值相差超过2度,还是仔细再找找吧
7楼2012-08-23 14:36:59
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-22 20:20:35
我用的条件是,
     95度 1分钟,
45 X  95度 15秒
     65度 (具体温度需要自己调整,我用的是65,他人可能一般用60度) 45秒
最后是MELT CUVE,
        95度   15秒
     65度   45秒
     95度   15秒

借鉴了!
8楼2012-08-23 14:37:27
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阿菁

新虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

9楼2012-11-01 12:01:43
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dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫

【答案】应助回帖

你们设计荧光的引物是用什么软件设计啊
好好学习,天天向上
10楼2012-12-03 11:34:30
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