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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR与普通PCR
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没入尘埃5

金虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR与普通PCR

我们实验室做检测时都是先用普通PCR检测，看着条带好再用实时定量检测，有一个基因在琼脂糖凝胶上看着条带是单一的，为什么在做荧光定量的时候溶解曲线是这样的呢？请大家多多帮助，十分感谢~~~
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如果不努力，肯定没收获！
1楼 2013-04-02 15:21:44
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没入尘埃5

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-04 13:41:18
做定量的话引物要求不能形成二聚体，因为引物二聚体也会发荧光，影响定量。而且引物二聚体的形成也会影响PCR的扩增效率。...

那你做过miRNA吗？知道植物miRNA的内参基因用什么吗？很多人说动植物通用U6，但是也有人说要用5S，我现在查不到关于5S的文献。还有，我现在PCR遇到的问题是，一个引物在一个模板PCR的时候挺好的，但是换了模板就效果不好了
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如果不努力，肯定没收获！
11楼2013-04-04 16:22:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-04-02 19:19:26
普通PCR检测灵敏度比荧光定量差很多。能看到条带时早就过了荧光定量的检测限。所以，即使普通PCR上是一条带，不一定说明荧光定量时候效果就很好。此外，荧光定量的酶和体系与普通PCR的不一样，普通PCR优化的最佳退火温度与荧光定量时未必一样。感觉你需要优化荧光定量PCR的反应程序。如果实在不行的话，说明可能需要更换引物。
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没入尘埃5
2楼2013-04-02 15:38:08
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没入尘埃5

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-02 15:38:08
普通PCR检测灵敏度比荧光定量差很多。能看到条带时早就过了荧光定量的检测限。所以，即使普通PCR上是一条带，不一定说明荧光定量时候效果就很好。此外，荧光定量的酶和体系与普通PCR的不一样，普通PCR优化的最佳退火 ...

嗯，就是说如果荧光定量的溶解曲线不好，就是效果不好，普通PCR那个其实不能说明什么问题啊
还有一个问题就是，我的看家基因普通PCR后，在4%的琼脂糖凝胶上显示两条带，我的目的基因是80bp左右的，还有一条在60bp左右，但是在荧光定量上的溶解曲线显示挺好的，这样是不是就没有问题?
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如果不努力，肯定没收获！
3楼2013-04-02 18:16:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
没入尘埃5: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-04-03 09:02:03
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-04-05 13:26:40
引用回帖:
3楼: Originally posted by 没入尘埃5 at 2013-04-02 18:16:32
嗯，就是说如果荧光定量的溶解曲线不好，就是效果不好，普通PCR那个其实不能说明什么问题啊
还有一个问题就是，我的看家基因普通PCR后，在4%的琼脂糖凝胶上显示两条带，我的目的基因是80bp左右的，还有一条在60bp ...

做荧光定量一般不看普通PCR的效果，的确是因为普通PCR结果好也根本不说明什么问题。但是，如果普通PCR显示有两条带，说明产物不单一，应该算是有问题吧。不知道你说的应该定量的熔接曲线好是什么意思。我觉得一般情况下普通PCR能P出两条带的话，荧光定量的熔接曲线应该很难是单一的锐峰。
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没入尘埃5
4楼2013-04-02 22:32:39
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