[求助] 相对荧光定量PCR

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1楼2013-07-02 20:59:51

cicelyzh

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crazymouse66: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢你的建议 2013-07-09 08:41:32

做60个循环也太多了吧。我怀疑你扩增的是什么。一般定量PCR的程序跑40或者45个循环。CT的最佳范围是15-30。你的熔解曲线好像也有问题。熔解温度太低，一般产物峰的熔解温度在80°C以上，七十多度的一般都是引物二聚体。你扩增的是用RNA反转录得到的第一链cDNA吗？

2楼2013-07-03 00:21:23

crazymouse66

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2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-03 00:21:23
做60个循环也太多了吧。我怀疑你扩增的是什么。一般定量PCR的程序跑40或者45个循环。CT的最佳范围是15-30。你的熔解曲线好像也有问题。熔解温度太低，一般产物峰的熔解温度在80°C以上，七十多度的一般都是引物二聚 ...

我用的是RNA反转录得到的第一链cDNA。这个不是引物二聚体，因为跑完QPCR后我又拿这个产物跑了电泳，结果条带很亮，不是引物二聚体。

3楼2013-07-03 08:48:09

vicky8685

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crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-09 08:39:56

你应该是做了两组检测，一组扩增曲线看上去效果还是可以的，但是CT值最多跑45循环，后面的一般是非特异性扩增很多，没有意义的
另外一组检测应该是你的引物探针没有设计好，出来的曲线乱七八糟。
现在有一步法的荧光PCR检测，不用两步这么麻烦，而且效果也好

怪兽

4楼2013-07-03 08:56:56

透明的玻璃杯

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在PCR过程中，常可见到循环次数到底应为多少的问题。简单计算就明白了。30循环，产物扩增量为2^30，近似为10^9，如果用1000个模板分子，则PCR后，总量为 1000*10^9=10^12, 其摩尔数=10^12/6.02*10^23=1.6*10^(-12)=1pmol
如果你的片段为200nt, 则PCR后的产物量=分子量*摩尔数=200*660*1.6*10^(-12)g=0.2*10^(-6)g=0.2ug
由此，可以看到正常PCR的扩增效率。

另：
PCR是，你的引物总量是？ 40个循环、50个循环、60个循环需要消耗多少引物？我就不细算了。

因此请各位做PCR时，最好计算一下

皇帝诞生地

5楼2013-07-03 09:28:48

crazymouse66

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4楼: Originally posted by vicky8685 at 2013-07-03 08:56:56
你应该是做了两组检测，一组扩增曲线看上去效果还是可以的，但是CT值最多跑45循环，后面的一般是非特异性扩增很多，没有意义的
另外一组检测应该是你的引物探针没有设计好，出来的曲线乱七八糟。
现在有一步法的荧 ...

是的，我是做了两组，好的那一组是我的内参，做的还比较好，另外那个歪歪曲曲的是我的目的基因，做之前我也用普通PCR做了一下，目的条带也很亮，所以就拿来做QPCR了。可能是引物的问题吧。

6楼2013-07-03 10:04:25

crazymouse66

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5楼: Originally posted by 透明的玻璃杯 at 2013-07-03 09:28:48
在PCR过程中，常可见到循环次数到底应为多少的问题。简单计算就明白了。30循环，产物扩增量为2^30，近似为10^9，如果用1000个模板分子，则PCR后，总量为 1000*10^9=10^12, 其摩尔数=10^12/6.02*10^23=1.6*10^(-12) ...

谢谢你详细的回答，在做之前我确实没有考虑这么多，刚开始只做了40个循环，但是扩增曲线还没有到达平稳期，所以我就直接加到60个循环了，确实没有仔细的算过。

7楼2013-07-03 10:06:25