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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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crazymouse66

金虫 (正式写手)

[求助] 相对荧光定量PCR

各位虫友，麻烦大家帮我看一下，我做的试试荧光定量PCR，其中溶解曲线都还可以，但是扩增曲线为什么会出现那种情况呢？真的不是很明白，请大家指导一下。其中我做了60个循环，里面初始的cDNA含量是9ng。
相对荧光定量PCR
扩增曲线.jpg


相对荧光定量PCR-1
溶解曲线.jpg
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1楼 2013-07-02 20:59:51
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-03 02:11:05
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-09 08:39:30
crazymouse66: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢你的建议 2013-07-09 08:41:32
做60个循环也太多了吧。我怀疑你扩增的是什么。一般定量PCR的程序跑40或者45个循环。CT的最佳范围是15-30。你的熔解曲线好像也有问题。熔解温度太低，一般产物峰的熔解温度在80°C以上，七十多度的一般都是引物二聚体。你扩增的是用RNA反转录得到的第一链cDNA吗？
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2楼2013-07-03 00:21:23
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crazymouse66

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-03 00:21:23
做60个循环也太多了吧。我怀疑你扩增的是什么。一般定量PCR的程序跑40或者45个循环。CT的最佳范围是15-30。你的熔解曲线好像也有问题。熔解温度太低，一般产物峰的熔解温度在80°C以上，七十多度的一般都是引物二聚 ...

我用的是RNA反转录得到的第一链cDNA。这个不是引物二聚体，因为跑完QPCR后我又拿这个产物跑了电泳，结果条带很亮，不是引物二聚体。
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3楼2013-07-03 08:48:09
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vicky8685

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-03 10:40:16
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-09 08:39:56
你应该是做了两组检测，一组扩增曲线看上去效果还是可以的，但是CT值最多跑45循环，后面的一般是非特异性扩增很多，没有意义的
另外一组检测应该是你的引物探针没有设计好，出来的曲线乱七八糟。
现在有一步法的荧光PCR检测，不用两步这么麻烦，而且效果也好
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怪兽
4楼2013-07-03 08:56:56
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透明的玻璃杯

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-07-03 10:40:29
crazymouse66: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-09 08:40:16
在PCR过程中，常可见到循环次数到底应为多少的问题。简单计算就明白了。30循环，产物扩增量为2^30，近似为10^9， 如果用1000个模板分子，则PCR后，总量为 1000*10^9=10^12, 其摩尔数=10^12/6.02*10^23=1.6*10^(-12)=1pmol
如果你的片段为200nt, 则PCR后的产物量=分子量*摩尔数=200*660*1.6*10^(-12)g=0.2*10^(-6)g=0.2ug
由此，可以看到正常PCR的扩增效率。

另：
PCR是，你的引物总量是？ 40个循环、50个循环、60个循环需要消耗多少引物？ 我就不细算了。

因此请各位做PCR时，最好计算一下
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皇帝诞生地
5楼2013-07-03 09:28:48
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crazymouse66

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by vicky8685 at 2013-07-03 08:56:56
你应该是做了两组检测，一组扩增曲线看上去效果还是可以的，但是CT值最多跑45循环，后面的一般是非特异性扩增很多，没有意义的
另外一组检测应该是你的引物探针没有设计好，出来的曲线乱七八糟。
现在有一步法的荧 ...

是的，我是做了两组，好的那一组是我的内参，做的还比较好，另外那个歪歪曲曲的是我的目的基因，做之前我也用普通PCR做了一下，目的条带也很亮，所以就拿来做QPCR了。可能是引物的问题吧。
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6楼2013-07-03 10:04:25
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crazymouse66

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 透明的玻璃杯 at 2013-07-03 09:28:48
在PCR过程中，常可见到循环次数到底应为多少的问题。简单计算就明白了。30循环，产物扩增量为2^30，近似为10^9， 如果用1000个模板分子，则PCR后，总量为 1000*10^9=10^12, 其摩尔数=10^12/6.02*10^23=1.6*10^(-12) ...

谢谢你详细的回答，在做之前我确实没有考虑这么多，刚开始只做了40个循环，但是扩增曲线还没有到达平稳期，所以我就直接加到60个循环了，确实没有仔细的算过。
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7楼2013-07-03 10:06:25
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zhouking8758

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-03 10:40:38
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-04 02:59:11
5楼说的对。循环数与你的引物用量，dNTP用量都是相关的。
扩增曲线不好的，都是模板浓度很低的吧。
另外，溶解曲线的起始温度可以低一点，比方说从你的退火温度开始（你不会采用的是两步PCR，退货温度直接和延伸温度相同吧？）
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8楼2013-07-03 10:24:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-04 02:59:21
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-09 08:40:50
引用回帖:
3楼: Originally posted by crazymouse66 at 2013-07-03 08:48:09
我用的是RNA反转录得到的第一链cDNA。这个不是引物二聚体，因为跑完QPCR后我又拿这个产物跑了电泳，结果条带很亮，不是引物二聚体。...

如果你确定是目标产物的话当然不错。不过，从扩增曲线上看，有些不是标准的S型，可能是基因的丰度低，需要增加模板的使用量。顺便问一下，你的cDNA浓度是怎样定的？
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9楼2013-07-03 23:15:31
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grape_vine

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-09 08:41:05
引用回帖:
7楼: Originally posted by crazymouse66 at 2013-07-03 10:06:25
谢谢你详细的回答，在做之前我确实没有考虑这么多，刚开始只做了40个循环，但是扩增曲线还没有到达平稳期，所以我就直接加到60个循环了，确实没有仔细的算过。...

40个循环都还没到平台期 应该先考虑增加模板
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10楼2013-07-03 23:25:22
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