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crazymouse66金虫 (正式写手)
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相对荧光定量PCR
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各位虫友，麻烦大家帮我看一下，我做的试试荧光定量PCR，其中溶解曲线都还可以，但是扩增曲线为什么会出现那种情况呢？真的不是很明白，请大家指导一下。其中我做了60个循环，里面初始的cDNA含量是9ng。 扩增曲线.jpg  溶解曲线.jpg |
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cicelyzh
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| 做60个循环也太多了吧。我怀疑你扩增的是什么。一般定量PCR的程序跑40或者45个循环。CT的最佳范围是15-30。你的熔解曲线好像也有问题。熔解温度太低，一般产物峰的熔解温度在80°C以上，七十多度的一般都是引物二聚体。你扩增的是用RNA反转录得到的第一链cDNA吗？ |
2楼2013-07-03 00:21:23
crazymouse66
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在PCR过程中，常可见到循环次数到底应为多少的问题。简单计算就明白了。30循环，产物扩增量为2^30，近似为10^9， 如果用1000个模板分子，则PCR后，总量为 1000*10^9=10^12, 其摩尔数=10^12/6.02*10^23=1.6*10^(-12)=1pmol 如果你的片段为200nt, 则PCR后的产物量=分子量*摩尔数=200*660*1.6*10^(-12)g=0.2*10^(-6)g=0.2ug 由此，可以看到正常PCR的扩增效率。 另： PCR是，你的引物总量是？ 40个循环、50个循环、60个循环需要消耗多少引物？ 我就不细算了。 因此请各位做PCR时，最好计算一下 |
5楼2013-07-03 09:28:48
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