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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 相对荧光定量PCR
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crazymouse66

金虫 (正式写手)

[求助] 相对荧光定量PCR

各位虫友，麻烦大家帮我看一下，我做的试试荧光定量PCR，其中溶解曲线都还可以，但是扩增曲线为什么会出现那种情况呢？真的不是很明白，请大家指导一下。其中我做了60个循环，里面初始的cDNA含量是9ng。
相对荧光定量PCR
扩增曲线.jpg


相对荧光定量PCR-1
溶解曲线.jpg
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1楼 2013-07-02 20:59:51
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crazymouse66

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by vicky8685 at 2013-07-03 08:56:56
你应该是做了两组检测，一组扩增曲线看上去效果还是可以的，但是CT值最多跑45循环，后面的一般是非特异性扩增很多，没有意义的
另外一组检测应该是你的引物探针没有设计好，出来的曲线乱七八糟。
现在有一步法的荧 ...

是的，我是做了两组，好的那一组是我的内参，做的还比较好，另外那个歪歪曲曲的是我的目的基因，做之前我也用普通PCR做了一下，目的条带也很亮，所以就拿来做QPCR了。可能是引物的问题吧。
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6楼2013-07-03 10:04:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-03 02:11:05
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-09 08:39:30
crazymouse66: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢你的建议 2013-07-09 08:41:32
做60个循环也太多了吧。我怀疑你扩增的是什么。一般定量PCR的程序跑40或者45个循环。CT的最佳范围是15-30。你的熔解曲线好像也有问题。熔解温度太低，一般产物峰的熔解温度在80°C以上，七十多度的一般都是引物二聚体。你扩增的是用RNA反转录得到的第一链cDNA吗？
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2楼2013-07-03 00:21:23
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crazymouse66

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-03 00:21:23
做60个循环也太多了吧。我怀疑你扩增的是什么。一般定量PCR的程序跑40或者45个循环。CT的最佳范围是15-30。你的熔解曲线好像也有问题。熔解温度太低，一般产物峰的熔解温度在80°C以上，七十多度的一般都是引物二聚 ...

我用的是RNA反转录得到的第一链cDNA。这个不是引物二聚体，因为跑完QPCR后我又拿这个产物跑了电泳，结果条带很亮，不是引物二聚体。
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3楼2013-07-03 08:48:09
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vicky8685

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-03 10:40:16
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-09 08:39:56
你应该是做了两组检测，一组扩增曲线看上去效果还是可以的，但是CT值最多跑45循环，后面的一般是非特异性扩增很多，没有意义的
另外一组检测应该是你的引物探针没有设计好，出来的曲线乱七八糟。
现在有一步法的荧光PCR检测，不用两步这么麻烦，而且效果也好
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怪兽
4楼2013-07-03 08:56:56
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