[求助] 相对荧光定量PCR

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1楼2013-07-02 20:59:51

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-04 02:59:21
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-09 08:40:50

引用回帖:

3楼: Originally posted by crazymouse66 at 2013-07-03 08:48:09
我用的是RNA反转录得到的第一链cDNA。这个不是引物二聚体，因为跑完QPCR后我又拿这个产物跑了电泳，结果条带很亮，不是引物二聚体。...

如果你确定是目标产物的话当然不错。不过，从扩增曲线上看，有些不是标准的S型，可能是基因的丰度低，需要增加模板的使用量。顺便问一下，你的cDNA浓度是怎样定的？

9楼2013-07-03 23:15:31

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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-03 02:11:05
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-09 08:39:30
crazymouse66: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢你的建议 2013-07-09 08:41:32

做60个循环也太多了吧。我怀疑你扩增的是什么。一般定量PCR的程序跑40或者45个循环。CT的最佳范围是15-30。你的熔解曲线好像也有问题。熔解温度太低，一般产物峰的熔解温度在80°C以上，七十多度的一般都是引物二聚体。你扩增的是用RNA反转录得到的第一链cDNA吗？

2楼2013-07-03 00:21:23

crazymouse66

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引用回帖:

2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-03 00:21:23
做60个循环也太多了吧。我怀疑你扩增的是什么。一般定量PCR的程序跑40或者45个循环。CT的最佳范围是15-30。你的熔解曲线好像也有问题。熔解温度太低，一般产物峰的熔解温度在80°C以上，七十多度的一般都是引物二聚 ...

我用的是RNA反转录得到的第一链cDNA。这个不是引物二聚体，因为跑完QPCR后我又拿这个产物跑了电泳，结果条带很亮，不是引物二聚体。

3楼2013-07-03 08:48:09

vicky8685

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【答案】应助回帖

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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-03 10:40:16
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-09 08:39:56

你应该是做了两组检测，一组扩增曲线看上去效果还是可以的，但是CT值最多跑45循环，后面的一般是非特异性扩增很多，没有意义的
另外一组检测应该是你的引物探针没有设计好，出来的曲线乱七八糟。
现在有一步法的荧光PCR检测，不用两步这么麻烦，而且效果也好

怪兽

4楼2013-07-03 08:56:56