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亚先

银虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR cq非数字是什么原因

求助 定量PCR cq非数字可能是什么原因呢？ 普通PCR内参和目的基因都可以跑出目的条带，一做定量就没有，请问这可能是哪方面原因导致的？
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说到做到这就是我的忍道
1楼2013-07-12 21:26:31
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
亚先: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-07-13 12:47:23
不知道你是应用那个程序，但一般没有数据的问题应该是你在设程序过程中，没有点击程序框里的暗图标，应该将循环程序中的最后一步下的图标点亮，这样系统就会接收数据，在最后分析中才会有曲线、峰值及结果。祝楼主顺利
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坚持就是胜利
2楼2013-07-13 07:27:19
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亚先

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 王艳xinwei at 2013-07-13 07:27:19
不知道你是应用那个程序，但一般没有数据的问题应该是你在设程序过程中，没有点击程序框里的暗图标，应该将循环程序中的最后一步下的图标点亮，这样系统就会接收数据，在最后分析中才会有曲线、峰值及结果。祝楼主顺 ...

谢谢 我能看到曲线，但是第一个像一头被风吹得飘散的长发  溶解曲线则没有峰，像U形。
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说到做到这就是我的忍道
3楼2013-07-13 12:54:07
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亚先

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 王艳xinwei at 2013-07-13 07:27:19
不知道你是应用那个程序，但一般没有数据的问题应该是你在设程序过程中，没有点击程序框里的暗图标，应该将循环程序中的最后一步下的图标点亮，这样系统就会接收数据，在最后分析中才会有曲线、峰值及结果。祝楼主顺 ...

我用的机器是Thermo 的PIKOREAL96，用的TOYOBO的THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix。约三个月前我还用同样的MIX做出结果过，（模板和引物不同）。
有没有可能是Mix出问题了？
定量PCR延伸的温度该如何确定呢？是和普通PCR的温度一样吗？
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说到做到这就是我的忍道
4楼2013-07-13 13:00:04
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亚先

银虫 (小有名气)
我用的机器是Thermo 的PIKOREAL96，用的TOYOBO的THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix。约三个月前我还用同样的MIX做出结果过，（模板和引物不同）。
有没有可能是Mix出问题了？
定量PCR延伸的温度该如何确定呢？是和普通PCR的温度一样吗？
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说到做到这就是我的忍道
5楼2013-07-13 13:00:10
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亚先

银虫 (小有名气)
扩增曲线
溶解曲线
反应程序
荧光定量PCR cq非数字是什么原因
Cq.jpg


荧光定量PCR cq非数字是什么原因-1
反应程序.jpg


荧光定量PCR cq非数字是什么原因-2
溶解.jpg
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说到做到这就是我的忍道
6楼2013-07-13 13:09:12
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 亚先 at 2013-07-13 13:00:04
我用的机器是Thermo 的PIKOREAL96，用的TOYOBO的THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix。约三个月前我还用同样的MIX做出结果过，（模板和引物不同）。
有没有可能是Mix出问题了？
定量PCR延伸的温度该如何确定呢？是和普通P ...

我们实验室是ABI7500，用的是Takara家的荧光试剂盒，反应体系：2×SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）10.0μL，50×ROX Reference DyeⅡ0.4 μL, 正反向引物 (10μmol·L−1) 各0.8μL, cDNA模板2.0μL，加水补足至20.0μL,  每个反应体系重复3次。 实时PCR扩增程序如下：94 ℃ 30 s; 94 ℃ 5 s, 58 ℃ 30 s, 72℃ 40 s, 40 个循环。
我估计是你的MIX有问题，荧光没有充分镶嵌。也有可能是你引物设计有问题，引物特异性怎么样，普通PCR电泳条带单一吗？
希望对楼主有帮助
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坚持就是胜利
7楼2013-07-16 12:14:39
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