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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 使用多对引物进行实时定量PCR后未得到实验结果，是否能说明目的基因不表达？
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A06060054

木虫 (正式写手)

[交流] 使用多对引物进行实时定量PCR后未得到实验结果，是否能说明目的基因不表达？

本人想检测体外培养淋巴细胞内CRHR2 mRNA的表达，设计了十多对引物，合成后进行实时定量PCR检测，但是都没有得到Ct值，说明没把基因扩增出来。这样是不是能说明这种基因在体外培养的淋巴细胞内无mRNA的表达？本人设计的引物都经过严格的验证，虽然引物有可能无效，但不应该都不好使呀。检测某种基因受否表达的要求和方法有没有标准啊？我这样下结论对吗？论文里可不可以这么写？

[ Last edited by A06060054 on 2013-3-22 at 11:19 ]
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1楼 2013-03-22 11:18:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
做正对照了吗？比方说内参是不是可以P出来？
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2楼2013-03-22 12:35:28
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的RNA质量如何，反转率效率呢，我觉得最好用这些引物先做个普通的RT-PCR检测一下上面的问题，当然，跟楼上所说，做个内标基因做参照，这样才能更好的说明问题
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3楼2013-03-22 16:19:38
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547star

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
设计引物参考的序列跟生物体实际的序列是否一致？也就是说，失败那么多，有没有用基因组DNA进行PCR扩增测序证明有这个基因？内参做出来了吗？
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4楼2013-03-22 17:49:48
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A06060054

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-22 12:35:28
做正对照了吗？比方说内参是不是可以P出来？

正对照是什么？是阳性对照吗？内参我做出来了啊，每个孔Ct值都是19点多。
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5楼2013-03-23 09:08:08
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A06060054

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by joan198108 at 2013-03-22 16:19:38
你的RNA质量如何，反转率效率呢，我觉得最好用这些引物先做个普通的RT-PCR检测一下上面的问题，当然，跟楼上所说，做个内标基因做参照，这样才能更好的说明问题

内参做出来了，Ct值比较理想，确定模板没有问题啊。就是目的基因没有结果，也没做普通PCR啊！有必要吗？普通PCR验证引物好使做实时一定好使吗？
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6楼2013-03-23 09:11:21
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A06060054

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 547star at 2013-03-22 17:49:48
设计引物参考的序列跟生物体实际的序列是否一致？也就是说，失败那么多，有没有用基因组DNA进行PCR扩增测序证明有这个基因？内参做出来了吗？

设计引物时基因序列是从NCBI上得到，动物种属也一致，基因组DNA应该是有这个基因吧！就是不知道在脾脏细胞内是否表达？所以这么做的。结果目的基因没做出来，内参做出来了，内参Ct值也比较理想啊。
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7楼2013-03-23 09:14:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2013-03-24 09:45:09
A06060054: 金币+5, 谢谢哦 2013-03-24 18:25:09
引用回帖:
5楼: Originally posted by A06060054 at 2013-03-23 09:08:08
正对照是什么？是阳性对照吗？内参我做出来了啊，每个孔Ct值都是19点多。...

你的引物如果能够P出基因组DNA，对从RNA反转录成cDNA却无法检出，而样品可以正常扩增出内参，至少可以说明目的基因表达水平很低。此外，你可以试试增加cDNA用量来P，看是否能P出来。
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8楼2013-03-23 09:16:20
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andywang6137

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2013-03-24 09:45:25
A06060054: 金币+5, 谢谢哦 2013-03-24 18:25:38
引用回帖:
7楼: Originally posted by A06060054 at 2013-03-23 09:14:16
设计引物时基因序列是从NCBI上得到，动物种属也一致，基因组DNA应该是有这个基因吧！就是不知道在脾脏细胞内是否表达？所以这么做的。结果目的基因没做出来，内参做出来了，内参Ct值也比较理想啊。...

再在已经报道的其他能够表达的组织中进行扩增，如果能够检测出来，就说明在实验组织表达很低或没有。
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9楼2013-03-24 08:43:17
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wchuangqi

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
A06060054: 金币+5, 谢谢哦！ 2013-03-24 18:24:55
首先检查一下RNA质量。
其次确定内参能扩出来，且Ct值比较正常
最后实验一定要有正对照，阴性结果什么都说明不了。你应该加上基因组DNA作为正对照
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10楼2013-03-24 15:30:35
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gmrice

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们做植物的一般可以做个野生型的对照，这样的话反转录的质量就不 用考虑了，因为野生型还扩不出来那肯定是反转录没做好，不知道你这个是不是可以做个对照，楼上说的阳性对照就是这个意思，让你找一个确定表达该基因的样品做对照，其实引物不是很大问题，一般软件设计的都可以扩出来。
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11楼2013-03-25 18:47:24
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