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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Realtime PCR 内参与目的基因问题
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caizeyuan922

铁杆木虫 (著名写手)

大虾

[求助] Realtime PCR 内参与目的基因问题

虫友们好，由于近期要做Realtime PCR，相对定量目的基因的表达变化，内参选定GAPDH，但是内参和目的基因扩增程序不一样，所以不能同一个批次做，只能分开，请问怎样还有意义吗？
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1楼 2012-09-27 10:42:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-27 14:03:48
caizeyuan922: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-27 20:06:49
设计引物的时候尽量使目的基因和内参的Tm值一致。还有就是扩增片段大小要尽量一致。如果目的基因和内参的丰度相差太远，需要调节模板用量，使其尽量在相同的循环下线性扩增。
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3楼2012-09-27 13:28:44
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494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-27 14:03:38
caizeyuan922: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2012-09-27 20:07:06
应该不行，要求目的基因与内参基因扩增效率一致（ΔE小于0.1）。如果你只是想摸索一下，你分开做最多可以提供一个参考。如果想用作论文里，我觉得不严谨，毕竟仪器的误差是没有办法避免的。
我建议你摸索一下目的基因的扩增程序。没有一个PCR必须要在某一个程序下才能P出来，换了一下就不行了。
我认为，你所谓的程序不一样，最重要的应该是Tm值。至于变性、预变性、延伸的时间以满足充分反应为原则，所以问题不大。循环数更不是问题了：35~40
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2楼2012-09-27 13:06:52
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
caizeyuan922: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-27 20:06:40
我觉得可以，用内参的作用不就是为了NORMALISE你的结果吗？只需要保证两引物扩增效率都在90-110%之间，扩增循环数相同就OK啊。
2楼说的仪器的误差无法避免，因为对于实时PCR，要求做至少3个生物学重复，至少2个技术重复，因此，再做重复的时候无法避免不同批次的误差，因而，我们只能认为仪器的误差为0，或者多做重复来减少误差。
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4楼2012-09-27 15:02:42
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xw19880905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
caizeyuan922: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-27 20:06:27
最好是在一个程序下跑，否则不严谨，误差太大，设计引物时就可以解决这个问题呀，两对引物的Tm值差不多就行
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5楼2012-09-27 17:06:18
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