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foodwl银虫 (初入文坛)
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[交流]
关于定量PCR做基因表达量的疑问 已有2人参与
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作为刚开始接触分子生物学的小白来说，实在是有太多的不懂，所用言语存在的不适当之处，还请大家多多批评指正。 表示一直对定量PCR的原理都看的不是太明白，不知道该怎么定一个相同的初始量来比较最终实时定量PCR的结果。 实验想要的是样品在不同贮藏时间中，某些基因得到表达量的变化。请教他人得来的最初方法是在提取总RNA之后，稀释全部样品的RNA浓度到统一的值，然后做反转录之后再将得到的所有样品的cDNA的浓度调整到一致，然后做半定量PCR之后得到合适的引物，就可以做定量PCR了 今天又听说，在半定量PCR的时候还要调整全部样品cDNA的量，使得所有样品在P内参基因后电泳的条带亮度一致，然后再用这个的量来进行定量PCR，这样再调整的话，岂不是之前的量就不一致了么？？？ 因为本是小白，是在是越来越晕，是有步骤重复了，还是怎样，到底该如何保证定量PCR之前样品量的一致性问题呢？ 实时定量的时候还是每个样品都要做一个内参么？ 求各位大侠相助，不胜感激  |
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owl2010
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半定量是这样操作的，反转录相同的RNA用量（如1ugRNA），用actin引物去扩增每个样本，虽然反转录用的是相同的RNA量，但是actin扩增出来的片段还是会有亮度差异的问题，这时就得根据不同的亮度调整每个模板的用量，待actin扩增的片段亮度调成大体一致后，每个模板的用量也会不尽相同，然后用基因的引物在每个模板里扩增，每个模板的用量和调好actin的模板用量一致，这样就会得到基因的表达量的差异。 定量PCR可以不调模板浓度，因为每个模板都要做内参，通过计算每个模板的内参来计算每个模板基因的表达量。 |
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foodwl
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