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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR数据处理——SD值及方差分析
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monazhou001

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR数据处理——SD值及方差分析已有1人参与

荧光定量PCR的数据
我的实验中有五种处理方法，每种方法三个生物学重复，每个生物学重复又在做荧光定量的时候做了三组复孔

1.三个重复处理顺序问题：
在做数据处理的时候应该是将三个生物学重复的内参CT做平均，目的基因CT做平均，然后整体做ΔCT 和SD，再做ΔΔCT
还是应该每个生物学重复先自己做ΔCT，得到三个ΔCT以后，再做平均，求三个ΔCT的SD值？这两种算法SD值不太相同。。

2.另外我的三个生物学重复之间重复性不好，处理明明是一样的，都在一个盆子里种的，这样应该怎么分析，应该剔除么？SD值很大很大。。如果不剔除发文章应该如何分析，能过么？

3.方差分析应该如何做？虽然做了三个生物学重复，可每种处理的ΔΔCT不是只有一个么，那2^(-ΔΔCT)只有一个怎么判断五种处理的差异显著性呢？

4.之前曾经做了另一个实验，是两种处理方法，11个不同品种，做荧光定量，因为样品很多，采用了混样法，就是只做了三次技术重复，并未做生物学重复，用实验组和对照组相对表达量2倍以上的算作了显著，这样如果发文章的话，能过么？老师让发plos one
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1楼2014-03-14 16:37:18
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
monazhou001(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-03-15 10:45:40
monazhou001: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-03-24 13:03:48
.....
    1. 内参的变动理应该变动不大，正确的算法是Sample减去平均后的内参，会得到三个deltaCT，这个自然有自己的SD
    2. 生物学重复的误差大就是实验设计问题，或者没有注意到细节，包括光照差异，处理时间等等。你可以剔除一个大离群值，做两个生物学重复也是可以的（我个人认为........）
  3. 统计学不是这么用的，我个人认为，你要用ANOVA就必须上重复实验，而不是拿生物学重复之间做比较，这是概念混淆。
  4. 我毫不客气地说：个人认为你这种做法纯粹是糊弄人，什么叫只做技术重复，技术重复能说明什么生物学问题？这只是看操作误差。你靠这种方式把SD Bar拉小，然后说明处理、样品间有差异，木有任何意义。
    个人看法，如有说错请高手指点。
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Let God do with it as He wills
2楼2014-03-14 22:23:43
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monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2014-03-14 22:23:43
.....
    1. 内参的变动理应该变动不大，正确的算法是Sample减去平均后的内参，会得到三个deltaCT，这个自然有自己的SD
    2. 生物学重复的误差大就是实验设计问题，或者没有注意到细节，包括光照差异，处理时间 ...

就是应该用内参的平均来得到三个样品的ΔCT，然后取平均？并用这三个ΔCT得到一个SD？在由此得到一个ΔΔCT结果，和最后的SD，是么？

方差是要做三次重复性试验得到三个ΔΔCT，最后做方差是这个意思么？
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3楼2014-03-20 10:50:51
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monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2014-03-14 22:23:43
.....
    1. 内参的变动理应该变动不大，正确的算法是Sample减去平均后的内参，会得到三个deltaCT，这个自然有自己的SD
    2. 生物学重复的误差大就是实验设计问题，或者没有注意到细节，包括光照差异，处理时间 ...

是不是对照组用三个ΔCT计算平均，而实验组得到三个ΔCT以后先分别计算ΔΔCT，得到三个ΔΔCT，然后用这三个ΔΔCT计算SD？
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4楼2014-03-20 16:32:57
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随风追梦

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2014-03-14 22:23:43
.....
    1. 内参的变动理应该变动不大，正确的算法是Sample减去平均后的内参，会得到三个deltaCT，这个自然有自己的SD
    2. 生物学重复的误差大就是实验设计问题，或者没有注意到细节，包括光照差异，处理时间 ...

你好，我现在遇到了和lz一样的问题，“正确的算法是Sample减去平均后的内参，会得到三个deltaCT，这个自然有自己的SD”那么计算delta delta Ct值时候难道是用三个“处理样品的delta Ct”分别减去”对照样品的delta Ct平均值“，这样三个delta delta Ct 值，然后再计算SD吗？这样的话最后delta delta Ct的SD值就只是由前面的“处理样品的delta Ct的SD值”主导的了啊？
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初心不改！
5楼2015-09-22 19:23:32
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liubolin945

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 随风追梦 at 2015-09-22 19:23:32
你好，我现在遇到了和lz一样的问题，“正确的算法是Sample减去平均后的内参，会得到三个deltaCT，这个自然有自己的SD”那么计算delta delta Ct值时候难道是用三个“处理样品的delta Ct”分别减去”对照样品的delta ...

关于这个问题我也想问问，
我做相对定量
每个样本3个重复（gene1三个重复：G1、G2、G3；GAPDH三个重复：A1、A2、A3）
那怎么计算ΔΔCt啊
带着SD计算吗？  那怎么算啊？
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QQ：277046172
6楼2016-02-18 20:43:02
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