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xiangquanju

金虫 (小有名气)

[求助] 绝对定量PCR中标准品的疑问? 已有4人参与

要做一个功能基因的绝对定量,样品有废水,土壤,大概40多个
现在要做标准曲线,打算用含有目的基因的质粒做模板,有个疑问请教一下大家,我是不是可以只从某一样品中扩增这个功能基因,转化质粒用来做标准品!因为考虑到不同物种之间基因序列也有微小的差别,这种差别是不是可以忽略
选择这个某一样品用来扩增这个功能基因的时候,有没有需要注意的地方!
做荧光定量PCR的新手,望大家多指教
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Jacob_24

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
xiangquanju(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-04-04 11:58:12
1.内参基因一般不会只选择一个 多选择几个吧,如果做真核的一般我们选B-actin,GAPDH,GUS...等
原核的话,你自己看看文献,选择几个内参
2.提醒一下,你构建的质粒,最后要切成线性
3.你检测的是很多样品中的某一个特定微生物物种的特定的某个/些基因,理论上可以从某个样品中扩,但最好如果有纯种微生物样品的DNA岂不是更好,减少干扰。
CCC
2楼2014-04-04 11:31:48
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Jacob_24

木虫 (正式写手)

CCC
3楼2014-04-04 11:32:42
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xiangquanju

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Jacob_24 at 2014-04-04 11:31:48
1.内参基因一般不会只选择一个 多选择几个吧,如果做真核的一般我们选B-actin,GAPDH,GUS...等
原核的话,你自己看看文献,选择几个内参
2.提醒一下,你构建的质粒,最后要切成线性
3.你检测的是很多样品中的某 ...

谢谢你的回复
你说的选择内参是做相对定量的时候需要使用的吧
我是要通过对某一功能基因进行定量PCR,来分析相应的微生物群落差异
看了一些文献,都是用这个基因构建了一个质粒来制作绝对定量中的标准曲线
4楼2014-04-08 09:45:03
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也要做绝对定量,但现在没什么头绪 用含目的基因的质粒做模板,测其浓度时候,是用微量紫外分光光度计吗?还有标准曲线是做出一条来就可以,还是每次都要用标准样品和待测样品一块跑荧光定量PCR啊?
5楼2014-04-08 17:29:50
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pingwei_622

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我现在也遇到类似的问题,求助~!
6楼2015-01-14 19:11:06
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wxl178725255

新虫 (初入文坛)

相对定量才做内参基因吧,一般选择2-3个内参比较妥当。
绝对定量制备标准曲线就好了,模板制备时需要注意的是,尽量选择基因保守区域,可从NCBI上参考序列进行比对,选择合适的序列扩增制备标准品。一般条带在500-700吧
7楼2015-05-26 10:55:17
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91candy

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Jacob_24 at 2014-04-04 11:31:48
1.内参基因一般不会只选择一个 多选择几个吧,如果做真核的一般我们选B-actin,GAPDH,GUS...等
原核的话,你自己看看文献,选择几个内参
2.提醒一下,你构建的质粒,最后要切成线性
3.你检测的是很多样品中的某 ...

为什么要切成线性呢?
8楼2016-04-01 08:29:56
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glovegong

新虫 (初入文坛)

同学,我也遇到了同样的问题,要用绝对荧光定量检测猪和小鼠某个功能基因的表达量,不知到符合原理吗,毕竟引物不同。同学,你怎么解决的,求教。谢谢,一定要联系我,604867048,谢谢你

发自小木虫Android客户端
9楼2017-01-09 12:56:12
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yjqhades

禁虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

10楼2017-01-09 16:12:06
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