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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 绝对定量PCR中标准品的疑问？
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xiangquanju

金虫 (小有名气)

[求助] 绝对定量PCR中标准品的疑问？ 已有4人参与

要做一个功能基因的绝对定量，样品有废水，土壤，大概40多个
现在要做标准曲线，打算用含有目的基因的质粒做模板，有个疑问请教一下大家，我是不是可以只从某一样品中扩增这个功能基因，转化质粒用来做标准品！因为考虑到不同物种之间基因序列也有微小的差别，这种差别是不是可以忽略
选择这个某一样品用来扩增这个功能基因的时候，有没有需要注意的地方！
做荧光定量PCR的新手，望大家多指教
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1楼 2014-04-04 10:35:55
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Jacob_24

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiangquanju(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-04-04 11:58:12
1.内参基因一般不会只选择一个 多选择几个吧，如果做真核的一般我们选B-actin，GAPDH，GUS...等
原核的话，你自己看看文献，选择几个内参
2.提醒一下，你构建的质粒，最后要切成线性
3.你检测的是很多样品中的某一个特定微生物物种的特定的某个/些基因，理论上可以从某个样品中扩，但最好如果有纯种微生物样品的DNA岂不是更好，减少干扰。
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CCC
2楼2014-04-04 11:31:48
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Jacob_24

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6812045你可以看看
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CCC
3楼2014-04-04 11:32:42
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Jacob_24 at 2014-04-04 11:31:48
1.内参基因一般不会只选择一个 多选择几个吧，如果做真核的一般我们选B-actin，GAPDH，GUS...等
原核的话，你自己看看文献，选择几个内参
2.提醒一下，你构建的质粒，最后要切成线性
3.你检测的是很多样品中的某 ...

谢谢你的回复
你说的选择内参是做相对定量的时候需要使用的吧
我是要通过对某一功能基因进行定量PCR，来分析相应的微生物群落差异
看了一些文献，都是用这个基因构建了一个质粒来制作绝对定量中的标准曲线
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4楼2014-04-08 09:45:03
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也要做绝对定量，但现在没什么头绪 用含目的基因的质粒做模板，测其浓度时候，是用微量紫外分光光度计吗？还有标准曲线是做出一条来就可以，还是每次都要用标准样品和待测样品一块跑荧光定量PCR啊？
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5楼2014-04-08 17:29:50
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pingwei_622

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我现在也遇到类似的问题，求助~！
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6楼2015-01-14 19:11:06
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wxl178725255

新虫 (初入文坛)
相对定量才做内参基因吧，一般选择2-3个内参比较妥当。
绝对定量制备标准曲线就好了，模板制备时需要注意的是，尽量选择基因保守区域，可从NCBI上参考序列进行比对，选择合适的序列扩增制备标准品。一般条带在500-700吧
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7楼2015-05-26 10:55:17
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91candy

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Jacob_24 at 2014-04-04 11:31:48
1.内参基因一般不会只选择一个 多选择几个吧，如果做真核的一般我们选B-actin，GAPDH，GUS...等
原核的话，你自己看看文献，选择几个内参
2.提醒一下，你构建的质粒，最后要切成线性
3.你检测的是很多样品中的某 ...

为什么要切成线性呢？
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8楼2016-04-01 08:29:56
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glovegong

新虫 (初入文坛)
同学，我也遇到了同样的问题，要用绝对荧光定量检测猪和小鼠某个功能基因的表达量，不知到符合原理吗，毕竟引物不同。同学，你怎么解决的，求教。谢谢，一定要联系我，604867048，谢谢你

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9楼2017-01-09 12:56:12
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yjqhades

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
10楼2017-01-09 16:12:06
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