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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » QPCR绝对定量，标准品
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)

[求助] QPCR绝对定量，标准品

QPCRde绝对定量，标准品怎么制备？求指点，看到好多地方用到质粒是怎么意思？偶是新手
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1楼2012-12-25 15:45:53
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回帖置顶 ( 共有1个 )

ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yanjiwuluo: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-25 20:46:33
amisking: 回帖置顶 2012-12-25 21:11:12
古可ぷ: 金币+1, 谢谢应助 2012-12-28 21:10:22
标准品一般用含有目的基因的质粒
知道质粒的分子量和浓度计算出拷贝数
然后倍比稀释就可以作为绝对定量的标准品了
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3楼2012-12-25 19:01:24
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lovelydong

铜虫 (小有名气)
★
古可ぷ: 金币+1, 欢迎探讨 2012-12-28 21:10:36
引用回帖:
8楼: Originally posted by yanjiwuluo at 2012-12-26 13:38:13
我要看微生物的抗性基因。老师不仅要相对定量的值，还要绝对定量的拷贝值.哎...又要克隆？那我看看相关的，我本来化学学得比较多，刚转向生物。我想了一下，不克隆是不是也行，直接用我的DNA模板进行，标准品稀释。 ...

你抽提的DNA模板才多少量啊，不然你测一下就知道了。不一般不够用来做长期标准品用的。
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9楼2012-12-28 11:25:36
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lovelydong

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yanjiwuluo: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-25 20:49:20
古可ぷ: 金币+1, 谢谢英子 2012-12-28 21:10:44
有一个方法：把目的基因p出来，然后接到质粒上，转染摇菌扩增，然后再抽质粒，酶切纯化。最后把纯化的目的基因做个鉴定。然后测定目的基因的量，计算出拷贝数。不过自制的标准品不太准。
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2楼2012-12-25 17:18:18
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ccharlien at 2012-12-25 19:01:24
标准品一般用含有目的基因的质粒
知道质粒的分子量和浓度计算出拷贝数
然后倍比稀释就可以作为绝对定量的标准品了

嗯，那质粒是可以买到的吗。要把目的基因弄到质粒里吗？
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4楼2012-12-25 20:46:17
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lovelydong at 2012-12-25 17:18:18
有一个方法：把目的基因p出来，然后接到质粒上，转染摇菌扩增，然后再抽质粒，酶切纯化。最后把纯化的目的基因做个鉴定。然后测定目的基因的量，计算出拷贝数。不过自制的标准品不太准。

呜呜...有没有不用质粒的，？感觉很深奥...
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5楼2012-12-25 20:49:16
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ccharlien

木虫 (正式写手)
★
古可ぷ: 金币+1, 谢谢提供 2012-12-28 21:10:58
引用回帖:
4楼: Originally posted by yanjiwuluo at 2012-12-25 20:46:17
嗯，那质粒是可以买到的吗。要把目的基因弄到质粒里吗？...

可以自己做 也可以买的到 要看你的基因了
你在NCBI查询基因信息的时候都能查到现有的cDNA克隆什么的
不过等寄过来还不如自己做个来的快
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6楼2012-12-25 21:07:41
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lovelydong

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yanjiwuluo at 2012-12-25 20:49:16
呜呜...有没有不用质粒的，？感觉很深奥......

用质粒是因为可以转染到菌体中（比如大肠杆菌，大量扩增制备），原理很简单的，你找找分子克隆的实验书看看就明白了。不知道楼主做什么研究，可以用相对定量的方法哦，数据之间比较更有说服力。
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7楼2012-12-26 11:00:56
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)
★ ★
古可ぷ: 金币+2, 感谢热情应助 2012-12-28 21:11:11
引用回帖:
7楼: Originally posted by lovelydong at 2012-12-26 11:00:56
用质粒是因为可以转染到菌体中（比如大肠杆菌，大量扩增制备），原理很简单的，你找找分子克隆的实验书看看就明白了。不知道楼主做什么研究，可以用相对定量的方法哦，数据之间比较更有说服力。...

我要看微生物的抗性基因。老师不仅要相对定量的值，还要绝对定量的拷贝值.哎...又要克隆？那我看看相关的，我本来化学学得比较多，刚转向生物。我想了一下，不克隆是不是也行，直接用我的DNA模板进行，标准品稀释。为什么非得弄得质粒里？》嘿嘿可能我还不明白原理
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8楼2012-12-26 13:38:13
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by lovelydong at 2012-12-28 11:25:36
你抽提的DNA模板才多少量啊，不然你测一下就知道了。不一般不够用来做长期标准品用的。...

50UL,有150ng/ul。
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10楼2012-12-28 15:12:17
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