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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于一对引物同时扩增多个不同基因的问题
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xin641685388

铁虫 (初入文坛)

[求助] 关于一对引物同时扩增多个不同基因的问题 已有1人参与

请教大家谁知道怎么设计一对引物同时去扩增多个不同基因呀，这多个基因是来自于同一基因组DNA的，引物特异性不用很好，只要扩增的目的片段里面有这几个基因的片段就可以，求助呀，请问大家谁知道这个引物要去怎么设计，需要什么软件吗？谢谢啦！
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1楼 2013-12-29 19:25:21
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-30 18:12:18
这个好办，你先把几个片段同源比对一下，找一样的区域，根据一样的区域设计引物，最好多设计几对PP看
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星陈代谢
2楼2013-12-30 08:27:13
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xin641685388

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kx444555 at 2013-12-30 08:27:13
这个好办，你先把几个片段同源比对一下，找一样的区域，根据一样的区域设计引物，最好多设计几对PP看

谢谢您的回复，我比对了，同源性非常低，忙活了一天，只找到了上游能完全和这五个基因配对的5个碱基。我是先在DNAMAN里比对这5个基因，几乎没有能连上的相同的碱基。您说把这5个能配对的碱基放到3‘端，在5’端多加几个简并碱基行吗？还有一个问题就是引物只有10bp左右，退火温度特别低怎么办？
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3楼2013-12-30 15:29:17
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-31 14:16:51
引用回帖:
3楼: Originally posted by xin641685388 at 2013-12-30 15:29:17
谢谢您的回复，我比对了，同源性非常低，忙活了一天，只找到了上游能完全和这五个基因配对的5个碱基。我是先在DNAMAN里比对这5个基因，几乎没有能连上的相同的碱基。您说把这5个能配对的碱基放到3‘端，在5’ ...

上游有配对的基因，下游没有也扩增不出，如果用DNAMAN 比的话，估计不准，DNAMAN是依照最大同源性的原则去比对的，有些局部区域有同源的显示不出来，你可以两条序列比一下，找同源区，然后看看同源区在其他基因有没有，5端肯定要加上简并碱基的，引物最好能到18BP，退火温度在55度以上，
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星陈代谢
4楼2013-12-31 09:24:47
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xin641685388

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kx444555 at 2013-12-31 09:24:47
上游有配对的基因，下游没有也扩增不出，如果用DNAMAN 比的话，估计不准，DNAMAN是依照最大同源性的原则去比对的，有些局部区域有同源的显示不出来，你可以两条序列比一下，找同源区，然后看看同源区在其他基因有没 ...

上下游我各找了3‘端5个碱基完全配对的引物，我打算5’端再加6、7个简并碱基，引物如果到18bp话那5‘端得13个简并碱基，这样可以吗？因为我的扩增不要求特异性很好，所以11、2个碱基是不是就行了？
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5楼2013-12-31 13:31:34
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
xin641685388: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-01-02 09:53:04
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星陈代谢
6楼2014-01-02 08:32:18
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gyl121

新虫 (正式写手)
退火温度高的也不一定都是好的，英文文献中的引物说是59度，可国内做出来只48度，也可以的，不过我在试，你可以设计两条，将你的序列分成两部分，设计成引物16bp左右就差不多了
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不经一番寒彻骨，怎得梅花扑鼻香？为科学进步不懈努力
7楼2014-01-05 22:10:29
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xin641685388

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by gyl121 at 2014-01-05 22:10:29
退火温度高的也不一定都是好的，英文文献中的引物说是59度，可国内做出来只48度，也可以的，不过我在试，你可以设计两条，将你的序列分成两部分，设计成引物16bp左右就差不多了

可是现在关键是这5个基因一比对基本没有什么同源性，我设计了三对不同长度的（7bp/10bp/12bp）的简并引物，这些引物都是3‘端的5个碱基能够和这5个基因互补配对，5’端分别加了2/5/7个简并碱基，设计完后Tm值太低了，只有2、30℃，如果再加长简并碱基的个数就太多了，怎么办呀，求助呀。
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8楼2014-01-07 15:52:23
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xin641685388

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by kx444555 at 2014-01-02 08:32:18
只要你能达到退火温度50度以上，估计问题也不大，...

我设计了三对不同长度的（7bp/10bp/12bp）的简并引物，这些引物都是3‘端的5个碱基能够和这5个基因互补配对，5’端分别加了2/5/7个简并碱基，设计完后Tm值太低了，只有2、30℃，如果再加长简并碱基的个数就太多了，怎么办呀，求助呀。
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9楼2014-01-07 16:11:04
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)
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星陈代谢
10楼2014-01-08 08:48:06
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