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崔永霞铁虫 (小有名气)
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引物设计 基因全长的获得
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| 各位高手想向大家请教一下，我想扩一个基因的全长，包括这个基因的内含子，我现在有这个基因的编码cDNA序列，我该如何设计引物才能扩出这个基因的包含内含子的全长呢？我是不是可以在编码框外设计引物呢？我前一段时间跨起始密码子和终止密码子设计了一对引物，特异性不是很好！郁闷的！ |
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1 所谓的基因的DNA序列,其实是很难确定的.因为你不知道这个基因编码区前面的调控区有多长. 2 一般说得到一个基因的DNA序列，是指包含了编码区和内含子的区域。 3 从你说的来看，你这个物种应该是没有基因组吧。那你就从已有序列的两头设计序列，在基因组上去扩增就是了。 扩不出来就换个位置。只要引物不是刚好就跨在内含子和外显子之间，扩增出来问题不打。 4 你所说的特异性不好不知道是什么情况？ 一般来说大家都喜欢扩增出来时单一条带。但是其实有背景也没关系。只要有主带，就可以继续往下做，无非是后面验证小心一点，测序多送两个。 5 另外，你知道大概扩增出来的序列有多长吗？ 如果你很不确定，那还是换引物慢慢试的好。 6 以上其实是一种最快的办法。如果一直失败，那可能还要walking。 但是在做walking之前，还是要选一段能在基因组上扩增出来的序列，好用来在上面设计引物。不然还是不能避免引物的问题。染色体步移对引物的要求更高。怎么做walking， 可以参看不同公司的试剂盒说明书，比教科书还清楚。 希望对你有所帮帮助！ |
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崔永霞10楼2013-08-09 16:18:31
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