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xin641685388

铁虫 (初入文坛)

[求助] 关于一对引物同时扩增多个不同基因的问题 已有1人参与

请教大家谁知道怎么设计一对引物同时去扩增多个不同基因呀,这多个基因是来自于同一基因组DNA的,引物特异性不用很好,只要扩增的目的片段里面有这几个基因的片段就可以,求助呀,请问大家谁知道这个引物要去怎么设计,需要什么软件吗?谢谢啦!
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xin641685388

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by gyl121 at 2014-01-05 22:10:29
退火温度高的也不一定都是好的,英文文献中的引物说是59度,可国内做出来只48度,也可以的,不过我在试,你可以设计两条,将你的序列分成两部分,设计成引物16bp左右就差不多了

可是现在关键是这5个基因一比对基本没有什么同源性,我设计了三对不同长度的(7bp/10bp/12bp)的简并引物,这些引物都是3‘端的5个碱基能够和这5个基因互补配对,5’端分别加了2/5/7个简并碱基,设计完后Tm值太低了,只有2、30℃,如果再加长简并碱基的个数就太多了,怎么办呀,求助呀。
8楼2014-01-07 15:52:23
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-30 18:12:18
这个好办,你先把几个片段同源比对一下,找一样的区域,根据一样的区域设计引物,最好多设计几对PP看
星陈代谢
2楼2013-12-30 08:27:13
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xin641685388

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kx444555 at 2013-12-30 08:27:13
这个好办,你先把几个片段同源比对一下,找一样的区域,根据一样的区域设计引物,最好多设计几对PP看

谢谢您的回复,我比对了,同源性非常低,忙活了一天,只找到了上游能完全和这五个基因配对的5个碱基。我是先在DNAMAN里比对这5个基因,几乎没有能连上的相同的碱基。您说把这5个能配对的碱基放到3‘端,在5’端多加几个简并碱基行吗?还有一个问题就是引物只有10bp左右,退火温度特别低怎么办?
3楼2013-12-30 15:29:17
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2013-12-31 14:16:51
引用回帖:
3楼: Originally posted by xin641685388 at 2013-12-30 15:29:17
谢谢您的回复,我比对了,同源性非常低,忙活了一天,只找到了上游能完全和这五个基因配对的5个碱基。我是先在DNAMAN里比对这5个基因,几乎没有能连上的相同的碱基。您说把这5个能配对的碱基放到3‘端,在5’ ...

上游有配对的基因,下游没有也扩增不出,如果用DNAMAN 比的话,估计不准,DNAMAN是依照最大同源性的原则去比对的,有些局部区域有同源的显示不出来,你可以两条序列比一下,找同源区,然后看看同源区在其他基因有没有,5端肯定要加上简并碱基的,引物最好能到18BP,退火温度在55度以上,
星陈代谢
4楼2013-12-31 09:24:47
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