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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 反向PCR之单引物扩增，真悲剧
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樱桃帮

新虫 (初入文坛)

[求助] 反向PCR之单引物扩增，真悲剧 已有2人参与

反向是P出来了，我要做反向的基因挺多的，但是好歹P出来了，条带也对。还挺高兴的。比对的时候就悲剧了，单引物扩增。还有一个基因更是夸张啊，比对时候连引物都找不到，我想问问做过的人，你们出现过这种诡异的现象不？老板催得紧，哎，你们懂得
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既来之则安之
1楼 2011-09-27 12:03:08
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cexoihtydx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 有经验的人了，呵呵 2011-09-30 23:41:07
樱桃帮(金币+1): 2011-10-19 10:29:30
楼主应该指的是自引物扩增的现象，如：一对引物扩增的目的片度，测序后发现上游和下游找到的都是上游引物或下游引物。NCBI比对后，也肯定不是目的基因的序列。这应该是设计的引物特异性不强，建议重新选择位点设计引物。当初，本人是通过大量挑取阳性菌测序解决的，比较浪费钱。
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不放弃，日子总有阳光，追求总有希望！
4楼2011-09-30 20:50:23
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普通回帖

樱桃帮

新虫 (初入文坛)
自己先顶下
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既来之则安之
2楼2011-09-27 12:04:09
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joyjane88

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-09-30 07:45:52
樱桃帮(金币+1): 2011-10-19 10:29:44
不太明白你究竟什么意思，一端特异引物另一端随机引物吗？
引物找不到很正常，测序时只能测到对面的引物，自身测不出来。可以让公司根据测序结果设计一个反向往回测一下。
不知对你有帮助没有。。。
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3楼2011-09-29 22:37:31
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樱桃帮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cexoihtydx at 2011-09-30 20:50:23:
楼主应该指的是自引物扩增的现象，如：一对引物扩增的目的片度，测序后发现上游和下游找到的都是上游引物或下游引物。NCBI比对后，也肯定不是目的基因的序列。这应该是设计的引物特异性不强，建议重新选择位点设计 ...

我是T克隆挑选出滞后菌，然后送出去测序，每次送出5个，但是每次结果都一样，即单引物扩增，我没有办法不得不重新开始做。
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既来之则安之
5楼2011-10-03 17:22:29
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cexoihtydx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

樱桃帮(金币+1): 2011-10-19 10:29:53
引用回帖:
5楼: Originally posted by 樱桃帮 at 2011-10-03 17:22:29:
我是T克隆挑选出滞后菌，然后送出去测序，每次送出5个，但是每次结果都一样，即单引物扩增，我没有办法不得不重新开始做。

看来形势不容乐观，只能重新设计引物重做了。祝福一切顺利
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不放弃，日子总有阳光，追求总有希望！
6楼2011-10-05 11:03:54
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
很正常，连接那一步检测了吗？
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jiayoubashaonian
7楼2011-10-05 14:18:01
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樱桃帮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-10-05 14:18:01:
很正常，连接那一步检测了吗？

T4连接纯化后，没有测浓度什么的，就直接做PCR了
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既来之则安之
8楼2011-10-12 14:15:03
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啮风

铜虫 (小有名气)
这个吧，楼主我要是没理解错的话，你说的应该是根据已知片段扩增两端序列的REVERSE PCR ？如果是这样的话，出现你所说的现象是正常的。
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9楼2011-10-12 23:11:27
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yubwer

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-10-19 18:56:18
1.再测序，反响；
2.这个也算正常情况
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10楼2011-10-13 16:25:24
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