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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Realtime PCR 内参与目的基因问题
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chenguestc

木虫 (职业作家)
引用回帖:
10楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-28 12:26:45
嗯...................
       任何说可能可以或者不可以的都是没有好好明白定量的意义
       定量再怎么说也是基于PCR的程序，虽然可以拿对数扩增区域的某一点被认为是与初始模板量呈现线性相关的（2的N次方） ...

PCR程序在每一个循环对于不同底物有任何扩增的差异，都会被后续的循环扩大，差异出现的越早，到达Ct值的时候这种差异就会越大，对于终点测定的RT-PCR就更为致命了。
是的，这个是对的。

你用不同程序，怎么保证两者处于同样的扩增水平？别告诉我说只要保证扩增效率一样就行了，那两次间机器中平行如何保证？
为什么非要两者扩增水平一样？有细微差别也不可以？例如，自己的引物扩增效率为95%（退火温度65度），而内参扩增效率98%（退火温度60度）。。。。。
如果只有少数几个样品，两次机器间的平行好弄，但是如果样品太多就无法保证啊，我有几千个样品，只能认为不同批次都是平行的啊。
请给予解释，为什么自己的引物和内参退火温度非得一致？？
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11楼2012-09-28 12:40:33
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
嗯..............
       那我就不明白了，为什么上千份样品要做定量，还是你们已经有了384板子的机器、排枪、Invitrogen最新的那个预混上样装置？普通的96孔机子怎么去做呢？
       对于第二条，你理解错误，有稍微的扩增差异偏差是可以，普遍认为2deltadelta-CT法可以容忍内参和样品扩增效率在90%~110%。这比你想象的要大，但是你认为的机器间平行好弄恰恰困难就在这里，试剂、上样的误差我们都能控制，而机器平行是无法控制的，不是说一样的机子一样的程序我们就能做出一样的结果，我经常会有上下午的结果有较大差异出现，如果你基因表达处理前后差异很大，那好说，趋势基本还是一样的。如果你基因表达差异很小，那这样做就会造成假象，到底是使基因表达上升还是下降？所以不是说扩增差异不能有，而是不能有你这种把内参和样品放两个机器上的做法。
       我们如果要做很多样品时，每一个板子都会带有内参并且有交叉样品，这样保证矫正样品（用内参）后还能在板子间对同样样品做矫正。
       还是那句话，定量PCR是极其敏感的东西，如果你要发高品质文章，每一步人家都会质问你怎么做的，所以在我们的领域，小量的基因表达调控大家都倾向于Northern，用定量太麻烦。但是，若一切前期准备都符合条件，定量是极其精确且极其敏感的，他的优点与缺点同样大。
       所以我觉的有些实验是否能用一种办法还是需要衡量一下的。
       有什么欢迎来问，祝实验顺利
       这也是我个人看法，若有说错请高手指点
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Let God do with it as He wills
12楼2012-09-28 13:59:00
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