应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Realtime PCR 内参与目的基因问题
52/1返回列表
查看: 4095  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

caizeyuan922

铁杆木虫 (著名写手)

大虾

[求助] Realtime PCR 内参与目的基因问题

虫友们好，由于近期要做Realtime PCR，相对定量目的基因的表达变化，内参选定GAPDH，但是内参和目的基因扩增程序不一样，所以不能同一个批次做，只能分开，请问怎样还有意义吗？
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2012-09-27 10:42:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
嗯..............
       那我就不明白了，为什么上千份样品要做定量，还是你们已经有了384板子的机器、排枪、Invitrogen最新的那个预混上样装置？普通的96孔机子怎么去做呢？
       对于第二条，你理解错误，有稍微的扩增差异偏差是可以，普遍认为2deltadelta-CT法可以容忍内参和样品扩增效率在90%~110%。这比你想象的要大，但是你认为的机器间平行好弄恰恰困难就在这里，试剂、上样的误差我们都能控制，而机器平行是无法控制的，不是说一样的机子一样的程序我们就能做出一样的结果，我经常会有上下午的结果有较大差异出现，如果你基因表达处理前后差异很大，那好说，趋势基本还是一样的。如果你基因表达差异很小，那这样做就会造成假象，到底是使基因表达上升还是下降？所以不是说扩增差异不能有，而是不能有你这种把内参和样品放两个机器上的做法。
       我们如果要做很多样品时，每一个板子都会带有内参并且有交叉样品，这样保证矫正样品（用内参）后还能在板子间对同样样品做矫正。
       还是那句话，定量PCR是极其敏感的东西，如果你要发高品质文章，每一步人家都会质问你怎么做的，所以在我们的领域，小量的基因表达调控大家都倾向于Northern，用定量太麻烦。但是，若一切前期准备都符合条件，定量是极其精确且极其敏感的，他的优点与缺点同样大。
       所以我觉的有些实验是否能用一种办法还是需要衡量一下的。
       有什么欢迎来问，祝实验顺利
       这也是我个人看法，若有说错请高手指点
赞一下 回复此楼
Let God do with it as He wills
12楼2012-09-28 13:59:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-27 14:03:38
caizeyuan922: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2012-09-27 20:07:06
应该不行，要求目的基因与内参基因扩增效率一致（ΔE小于0.1）。如果你只是想摸索一下，你分开做最多可以提供一个参考。如果想用作论文里，我觉得不严谨，毕竟仪器的误差是没有办法避免的。
我建议你摸索一下目的基因的扩增程序。没有一个PCR必须要在某一个程序下才能P出来，换了一下就不行了。
我认为，你所谓的程序不一样，最重要的应该是Tm值。至于变性、预变性、延伸的时间以满足充分反应为原则，所以问题不大。循环数更不是问题了：35~40
赞一下 回复此楼
2楼2012-09-27 13:06:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-27 14:03:48
caizeyuan922: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-27 20:06:49
设计引物的时候尽量使目的基因和内参的Tm值一致。还有就是扩增片段大小要尽量一致。如果目的基因和内参的丰度相差太远，需要调节模板用量，使其尽量在相同的循环下线性扩增。
赞一下 回复此楼
3楼2012-09-27 13:28:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
caizeyuan922: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-27 20:06:40
我觉得可以，用内参的作用不就是为了NORMALISE你的结果吗？只需要保证两引物扩增效率都在90-110%之间，扩增循环数相同就OK啊。
2楼说的仪器的误差无法避免，因为对于实时PCR，要求做至少3个生物学重复，至少2个技术重复，因此，再做重复的时候无法避免不同批次的误差，因而，我们只能认为仪器的误差为0，或者多做重复来减少误差。
赞一下 回复此楼
4楼2012-09-27 15:02:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭