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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Realtime PCR 内参与目的基因问题
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caizeyuan922

铁杆木虫 (著名写手)

大虾

[求助] Realtime PCR 内参与目的基因问题

虫友们好，由于近期要做Realtime PCR，相对定量目的基因的表达变化，内参选定GAPDH，但是内参和目的基因扩增程序不一样，所以不能同一个批次做，只能分开，请问怎样还有意义吗？
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1楼 2012-09-27 10:42:37
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chenguestc

木虫 (职业作家)
引用回帖:
10楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-28 12:26:45
嗯...................
       任何说可能可以或者不可以的都是没有好好明白定量的意义
       定量再怎么说也是基于PCR的程序，虽然可以拿对数扩增区域的某一点被认为是与初始模板量呈现线性相关的（2的N次方） ...

PCR程序在每一个循环对于不同底物有任何扩增的差异，都会被后续的循环扩大，差异出现的越早，到达Ct值的时候这种差异就会越大，对于终点测定的RT-PCR就更为致命了。
是的，这个是对的。

你用不同程序，怎么保证两者处于同样的扩增水平？别告诉我说只要保证扩增效率一样就行了，那两次间机器中平行如何保证？
为什么非要两者扩增水平一样？有细微差别也不可以？例如，自己的引物扩增效率为95%（退火温度65度），而内参扩增效率98%（退火温度60度）。。。。。
如果只有少数几个样品，两次机器间的平行好弄，但是如果样品太多就无法保证啊，我有几千个样品，只能认为不同批次都是平行的啊。
请给予解释，为什么自己的引物和内参退火温度非得一致？？
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11楼2012-09-28 12:40:33
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494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-27 14:03:38
caizeyuan922: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2012-09-27 20:07:06
应该不行，要求目的基因与内参基因扩增效率一致（ΔE小于0.1）。如果你只是想摸索一下，你分开做最多可以提供一个参考。如果想用作论文里，我觉得不严谨，毕竟仪器的误差是没有办法避免的。
我建议你摸索一下目的基因的扩增程序。没有一个PCR必须要在某一个程序下才能P出来，换了一下就不行了。
我认为，你所谓的程序不一样，最重要的应该是Tm值。至于变性、预变性、延伸的时间以满足充分反应为原则，所以问题不大。循环数更不是问题了：35~40
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2楼2012-09-27 13:06:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-27 14:03:48
caizeyuan922: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-27 20:06:49
设计引物的时候尽量使目的基因和内参的Tm值一致。还有就是扩增片段大小要尽量一致。如果目的基因和内参的丰度相差太远，需要调节模板用量，使其尽量在相同的循环下线性扩增。
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3楼2012-09-27 13:28:44
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
caizeyuan922: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-27 20:06:40
我觉得可以，用内参的作用不就是为了NORMALISE你的结果吗？只需要保证两引物扩增效率都在90-110%之间，扩增循环数相同就OK啊。
2楼说的仪器的误差无法避免，因为对于实时PCR，要求做至少3个生物学重复，至少2个技术重复，因此，再做重复的时候无法避免不同批次的误差，因而，我们只能认为仪器的误差为0，或者多做重复来减少误差。
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4楼2012-09-27 15:02:42
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