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1楼2013-11-07 20:26:09

三蛰

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marker都出现弥散了，只有两种原因：1，你的marker质量出现问题。2，你的凝胶分辨率太高，将marker都给分辨了。但是第一个问题一般不会出现，所以应该是凝胶的分辨率太高，电压和胶浓度都有影响，稍微降低一下胶的浓度可以改观。

我不会！

2楼2013-11-08 11:01:21

wanghx_2012

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请你把电泳的条件列出来，包括电压，胶浓度，电泳时间，电流大小，再作分析。

3楼2013-11-08 13:52:42

子潇杨帆

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3楼: Originally posted by wanghx_2012 at 2013-11-08 13:52:42
请你把电泳的条件列出来，包括电压，胶浓度，电泳时间，电流大小，再作分析。

电泳条件：电压120，电流190，功率40；2%琼脂糖凝胶；电泳时间我一般以电泳的条带跑到整个胶块的3/4处停止，如果是大胶的话一个多小时吧，如果是大胶的一半就大约40分钟~50分钟。希望前辈给予指点~~

4楼2013-11-08 15:10:32

子潇杨帆

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2楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-11-08 11:01:21
marker都出现弥散了，只有两种原因：1，你的marker质量出现问题。2，你的凝胶分辨率太高，将marker都给分辨了。但是第一个问题一般不会出现，所以应该是凝胶的分辨率太高，电压和胶浓度都有影响，稍微降低一下胶的浓 ...

我用的胶浓度为2%的，我会尝试一下降低胶的浓度，十分感谢！

5楼2013-11-08 15:11:40

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子潇杨帆: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-09 10:10:12

楼主的PCR扩增出现涂抹带或片状带或地毯样带。

PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因与对策

2013年8月23日总结（第二次修订，加上序号，使文章的层次清晰，另外修正了错漏之处）
2013年10月9日凌晨第三次修改补充。

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差或酶的专一性不够，DNA模板量过大，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，模板长于3kd所引起。

其对策有：
  1.减少酶量（一般以2单位Taq DNA聚合酶为基点，分梯度上下调一调，其他酶也差不多如此浓度，可以参考说明书）；加强DNA聚合酶的专一性或调换另一来源的专一性更好的DNA聚合酶。
  2. 增加DNA聚合酶的专一性。
（1）改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。
（2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油，若此操作引起酶的浓度过高，可以适当加双蒸馏水稀释。
（3）为了加强Taq DNA聚合酶的专一性。的专一性，可在反应体系中加入：1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以增加Taq DNA聚合酶的稳定性。
3.适当减少dNTP的浓度；减少dNTP的浓度一般需要与降低Mg2+浓度同方向偶联进行，但是不必按同样的比例。
4.适当降低Mg2+浓度，可以采用梯度递减方式，以每次0.5mol/L递减，但是Mg2+的终浓度不要低于1.0mol/L。
5. 缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。
6.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
7.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。使用热启动模式。使用热启动时可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。
8. 保证PCR反应的DNA模板的质量，要用电泳检测一下分子量和纯度，质量不好则要重新提取和纯化DNA模板；适当增加DNA模板量，减少循环次数。
9.以上措施都不行时，最后就只能重新设计引物，加强引物的专一性。
10.适当减少DNA模板量。
11.适当减少循环次数，一般也就循环25次就差不多了。
12.如果楼主的PCR模板是3kd或者更大，用普通PCR效果大概不会很理想，应该考虑使用Long-Range PCR。

本回答是我刚刚做的修改和补充的此类问题的回答，并不是照抄我以前的同类问题的解答内容。

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6楼2013-11-09 02:44:55