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lvsihan

银虫 (正式写手)

[求助] 革兰氏阳性菌的PCR方法

实验需要克隆革兰氏阳性菌的某段基因，3000bp左右，想问一下如果直接使用菌落用于pcr的话，菌落长到多大比较合适呢？在pcr过程中有什么需要注意的吗？
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1楼 2013-08-13 08:44:34
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 专家考核, 专家辛苦了 2013-08-13 17:19:13
直接使用菌落用于pcr的话，菌落长到你能挑取就行了，然后加30-50ul水煮沸个半小时左右，吸取少量上清直接做模板PCR。
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2楼2013-08-13 10:39:43
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lvsihan

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-08-13 10:39:43
直接使用菌落用于pcr的话，菌落长到你能挑取就行了，然后加30-50ul水煮沸个半小时左右，吸取少量上清直接做模板PCR。

直接用菌落不处理可以吗？菌落大小的量对PCR结果有什么影响吗？
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3楼2013-08-13 16:20:54
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莓林塔

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-14 17:53:03
阳性菌的话还是进行下破壁处理吧，直接菌落P也许会出不来吧？先把菌落挑到10ulTE或水里然后反复煮冻几次然后把这10ul直接补齐到PCR体系里吧，注意洁净哦~
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4楼2013-08-13 16:29:35
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-22 21:18:37
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvsihan at 2013-08-13 16:20:54
直接用菌落不处理可以吗？菌落大小的量对PCR结果有什么影响吗？...

直接用菌落不处理很难P出来的；如果不是定量PCR的话，菌落大小的量对PCR阴阳性结果没影响的。
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5楼2013-08-13 17:29:50
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小小_木虫

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-14 17:53:16
枯草芽孢杆菌的PCR我们都是直接用新培养出来的菌P的，老师不建议菌落长时间太长，用10uL枪头尖挑取一点就可以了，跟阴性菌的挑法一样。至于菌落长大多大，我觉得长到PCR挑完菌还剩下点就可以了，别太小，到时候验证正确了，菌没了……。楼上几位的处理我没有试过，应该是比较保险的做法吧，是不是跟菌有关，我们的比较容易。
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6楼2013-08-14 15:40:57
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lvsihan

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 莓林塔 at 2013-08-13 16:29:35
阳性菌的话还是进行下破壁处理吧，直接菌落P也许会出不来吧？先把菌落挑到10ulTE或水里然后反复煮冻几次然后把这10ul直接补齐到PCR体系里吧，注意洁净哦~

谢谢！
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7楼2013-08-15 09:23:50
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lvsihan

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小小_木虫 at 2013-08-14 15:40:57
枯草芽孢杆菌的PCR我们都是直接用新培养出来的菌P的，老师不建议菌落长时间太长，用10uL枪头尖挑取一点就可以了，跟阴性菌的挑法一样。至于菌落长大多大，我觉得长到PCR挑完菌还剩下点就可以了，别太小，到时候验证 ...

哦，非常感谢！！！
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8楼2013-08-15 09:24:43
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lvsihan

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 莓林塔 at 2013-08-13 16:29:35
阳性菌的话还是进行下破壁处理吧，直接菌落P也许会出不来吧？先把菌落挑到10ulTE或水里然后反复煮冻几次然后把这10ul直接补齐到PCR体系里吧，注意洁净哦~

谢谢！！！
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9楼2013-08-15 16:11:32
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caoying辉

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-08-22 19:51:48
OD=0.5-0.6时，拿出来离心做菌体PCR
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10楼2013-08-15 21:33:02
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