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lvsihan

银虫 (正式写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by caoying辉 at 2013-08-15 21:33:02
OD=0.5-0.6时,拿出来离心做菌体PCR

谢谢你!
11楼2013-08-16 10:41:06
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lvsihan

银虫 (正式写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by caoying辉 at 2013-08-15 21:33:02
OD=0.5-0.6时,拿出来离心做菌体PCR

菌体不需要破壁什么的吗?
12楼2013-08-16 20:24:23
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coca8831

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-17 12:33:34
我是用摇24小时的菌液,不做任何处理直接取1微升直接进行PCR,应该没问题
勤奋的闲逛ing
13楼2013-08-17 09:48:49
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lvsihan

银虫 (正式写手)

引用回帖:
13楼: Originally posted by coca8831 at 2013-08-17 09:48:49
我是用摇24小时的菌液,不做任何处理直接取1微升直接进行PCR,应该没问题

可是我怎么做都做不出来,难道是我合成的引物有问题吗?
14楼2013-08-22 09:41:49
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coca8831

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-22 19:52:00
抱歉没看清楚你用的菌种类,我用的是大肠杆菌(应该是革兰氏阴性)。挑克隆后摇菌过夜,然后取1微升的菌液,不做处理,直接进行PCR。和提取质粒后在进行PCR,阳性率稍微低一些,但基本差不多。PCR阳性的进行酶切,大约50%的可以切出来吧。

供你参考
勤奋的闲逛ing
15楼2013-08-22 16:07:44
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by coca8831 at 2013-08-22 16:07:44
抱歉没看清楚你用的菌种类,我用的是大肠杆菌(应该是革兰氏阴性)。挑克隆后摇菌过夜,然后取1微升的菌液,不做处理,直接进行PCR。和提取质粒后在进行PCR,阳性率稍微低一些,但基本差不多。PCR阳性的进行酶切,大 ...

楼主是要从细菌基因组上克隆基因,不是做质粒阳性验证
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
16楼2013-08-22 21:19:56
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

菌落PCR的话对菌落大小没有要求,有菌就好。不过你是想克隆基因,强烈建议你提取基因组,然后再用高保真酶PCR。根据我的经验,在保真度上,用纯DNA做模板比菌落好很多!Good luck!
互助互励,共奋共进!!
17楼2013-08-22 23:10:48
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