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11楼2013-08-16 10:41:06

lvsihan

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10楼: Originally posted by caoying辉 at 2013-08-15 21:33:02
OD=0.5-0.6时，拿出来离心做菌体PCR

菌体不需要破壁什么的吗？

12楼2013-08-16 20:24:23

coca8831

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★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-17 12:33:34

我是用摇24小时的菌液，不做任何处理直接取1微升直接进行PCR，应该没问题

勤奋的闲逛ing

13楼2013-08-17 09:48:49

lvsihan

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13楼: Originally posted by coca8831 at 2013-08-17 09:48:49
我是用摇24小时的菌液，不做任何处理直接取1微升直接进行PCR，应该没问题

可是我怎么做都做不出来，难道是我合成的引物有问题吗？

14楼2013-08-22 09:41:49

coca8831

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-22 19:52:00

抱歉没看清楚你用的菌种类，我用的是大肠杆菌（应该是革兰氏阴性）。挑克隆后摇菌过夜，然后取1微升的菌液，不做处理，直接进行PCR。和提取质粒后在进行PCR，阳性率稍微低一些，但基本差不多。PCR阳性的进行酶切，大约50%的可以切出来吧。

供你参考

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15楼2013-08-22 16:07:44

gyesang

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引用回帖:

15楼: Originally posted by coca8831 at 2013-08-22 16:07:44
抱歉没看清楚你用的菌种类，我用的是大肠杆菌（应该是革兰氏阴性）。挑克隆后摇菌过夜，然后取1微升的菌液，不做处理，直接进行PCR。和提取质粒后在进行PCR，阳性率稍微低一些，但基本差不多。PCR阳性的进行酶切，大 ...

楼主是要从细菌基因组上克隆基因，不是做质粒阳性验证

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16楼2013-08-22 21:19:56

Sthunder

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【答案】应助回帖

菌落PCR的话对菌落大小没有要求，有菌就好。不过你是想克隆基因，强烈建议你提取基因组，然后再用高保真酶PCR。根据我的经验，在保真度上，用纯DNA做模板比菌落好很多！Good luck！

互助互励，共奋共进！！

17楼2013-08-22 23:10:48