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lvsihan

银虫 (正式写手)

[求助] 革兰氏阳性菌的PCR方法

实验需要克隆革兰氏阳性菌的某段基因,3000bp左右,想问一下如果直接使用菌落用于pcr的话,菌落长到多大比较合适呢?在pcr过程中有什么需要注意的吗?
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by coca8831 at 2013-08-22 16:07:44
抱歉没看清楚你用的菌种类,我用的是大肠杆菌(应该是革兰氏阴性)。挑克隆后摇菌过夜,然后取1微升的菌液,不做处理,直接进行PCR。和提取质粒后在进行PCR,阳性率稍微低一些,但基本差不多。PCR阳性的进行酶切,大 ...

楼主是要从细菌基因组上克隆基因,不是做质粒阳性验证
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
16楼2013-08-22 21:19:56
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 专家考核, 专家辛苦了 2013-08-13 17:19:13
直接使用菌落用于pcr的话,菌落长到你能挑取就行了,然后加30-50ul水煮沸个半小时左右,吸取少量上清直接做模板PCR。
2楼2013-08-13 10:39:43
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lvsihan

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-08-13 10:39:43
直接使用菌落用于pcr的话,菌落长到你能挑取就行了,然后加30-50ul水煮沸个半小时左右,吸取少量上清直接做模板PCR。

直接用菌落不处理可以吗?菌落大小的量对PCR结果有什么影响吗?
3楼2013-08-13 16:20:54
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莓林塔

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-14 17:53:03
阳性菌的话还是进行下破壁处理吧,直接菌落P也许会出不来吧?先把菌落挑到10ulTE或水里然后反复煮冻几次然后把这10ul直接补齐到PCR体系里吧,注意洁净哦~
4楼2013-08-13 16:29:35
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