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诚心求教各位前辈：筛选扩增体系时的PCR图片，这是怎么回事啊？
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紧急求教各位前辈： 刚开始做SCoT分子标记对玫瑰的最优扩增体系的筛选，刚刚开始跑PCR（普通的），结果结果成了这样，弥散的好厉害，尤其是第二次跑的这次，连marker都看不清楚，像重影似的，请教各位前辈能否给以指点，诚心求教出现这种情况的原因是什么，我该怎么解决啊？？？ 我的扩增程序设定的为：94℃预变性 5 min；94℃变性 1 min，50℃退火 1 min，72℃ 延伸 2 min，共 36 个循环；72℃最后延伸 10 min。   11-7（筛）_副本.jpg  11-7（筛2）_副本.jpg |
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 核酸生物学实验经验 |
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2楼2013-11-08 11:01:21
wanghx_2012
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楼主的PCR扩增出现涂抹带或片状带或地毯样带。 PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因与对策 2013年8月23日总结（第二次修订，加上序号，使文章的层次清晰，另外修正了错漏之处） 2013年10月9日凌晨第三次修改补充。 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。 其原因往往由于酶量过多或酶的质量差或酶的专一性不够，DNA模板量过大，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，模板长于3kd所引起。 其对策有： 1.减少酶量（一般以2单位Taq DNA聚合酶为基点，分梯度上下调一调，其他酶也差不多如此浓度，可以参考说明书）；加强DNA聚合酶的专一性或调换另一来源的专一性更好的DNA聚合酶。 2. 增加DNA聚合酶的专一性。 （1）改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。 （2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油，若此操作引起酶的浓度过高，可以适当加双蒸馏水稀释。 （3）为了加强Taq DNA聚合酶的专一性。 的专一性，可在反应体系中加入：1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以增加Taq DNA聚合酶的稳定性。 3.适当减少dNTP的浓度；减少dNTP的浓度一般需要与降低Mg2+浓度同方向偶联进行，但是不必按同样的比例。 4.适当降低Mg2+浓 度，可以采用梯度递减方式，以每次0.5mol/L递减，但是Mg2+的终浓度不要低于1.0mol/L。 5. 缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。 6.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。 7.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。使用热启动模式。使用热启动时可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。 8. 保证PCR反应的DNA模板的质量，要用电泳检测一下分子量和纯度，质量不好则要重新提取和纯化DNA模板；适当增加DNA模板量，减少循环次数。 9.以上措施都不行时，最后就只能重新设计引物，加强引物的专一性。 10.适当减少DNA模板量。 11.适当减少循环次数，一般也就循环25次就差不多了。 12.如果楼主的PCR模板是3kd或者更大，用普通PCR效果大概不会很理想，应该考虑使用Long-Range PCR。 本回答是我刚刚做的修改和补充的此类问题的回答，并不是照抄我以前的同类问题的解答内容。 |
6楼2013-11-09 02:44:55
