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xuemei1984

禁虫 (小有名气)

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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by xuemei1984 at 2012-06-23 10:41:36
引物设计时,两个软件计算的Tm值都挺高的,符合要求。只是引物合成回来Tm值低了好多。...

引物合成回来Tm值低了好多更说明你的引物不合适了,引物间GC AT分布不够均匀,建议用2个引物设计软件都去检测Tm,(我是这样做的)
9楼2012-06-23 15:55:11
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l_h_10

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助哦 2012-06-22 13:33:39
xuemei1984: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-06-23 09:57:10
从图上看,是引物二聚体的峰有干扰,我觉得可以减少引物量。之前也为这个问题困扰过,我的问题是普通定量出现引物二聚体,实时定量也出现,后面把引物量减少一半就好了(试过把引物量减少一倍或者把模板量加大一倍,发现引物量减少效果更好)。
2楼2012-06-21 23:03:54
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

改三步法试试吧,可以显著改善特异性。
3楼2012-06-22 00:56:19
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
xuemei1984: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-06-23 09:57:58
从图中我觉得还是引物不合适。建议:较严格按着realtime-PCR引物设计原则设计,引物Tm高些。还有做PCR时,药品颠倒混匀,尤其是SYBR,我在做试验中觉得PCR mixture 混合不好,也影响PCR扩增。 这个不错你可以看看《TAKARA荧光定量PCR宝典》
4楼2012-06-22 16:22:31
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