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anny66cb

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[资源] 【分享】realtime pcr 个人经验分享

2009年的下半年我一直在跟RNA提取、逆转录和SYBR GREEN realtime-PCR反应做斗争，现在已经告别当初的迷茫，当别人问自己的时候，也能说出个一二五来了，很高兴。当时在我艰难摸索的时候就想，等我都学会了，我一定要写篇帖子，把一个初学者最初的想法和觉得矛盾、困难、不知如何入手的方法、难点和最后解决的办法写出来，一来可以帮助更多像我这样的人，二来也算让自己有点成就感了，三就是希望版主给我加点分数了。呵呵。好了，现在开始吧。
1.  ABI7000的仪器如何做溶解曲线：我们单位刚开始的时候只有一台仪器ABI7000，其他人都是用taqman探针做的，而且只是对结果进行定性分析。我用的是SYBR green 染料，是需要做溶解曲线的，关于设置的问题就来了，设置好PCR的程序以后，在程序下方有一个框框，具体我忘了，把那个框框打上勾就好了,溶解曲线的温度是不能高于60的，所以我的有部分产物解链温度太高了，出来的溶解曲线只能出来半侧峰或者没有峰。后来单位又购进了一台ROCHE 480 lightcycleR能设置溶解曲线的反应程序，这个问题就解决了。
2.  阈值的调整：一般设在最大荧光信号的1/5,或是R2最大时的CT值为阈值标准，根据不同的仪器选择。
3.  扩增效率的问题：lightcycle扩增效率在1.9-2.05之间认为结果是可以应用的，有可比性。其它仪器是90-105%，因为我没用过其它的仪器，有见过这种仪器类型的网友可以补充一下。
4.  realtime pcr的重复性问题：通常相同试剂、相同模版、同一个反映条件CT不要相差一个循环以外。比如复孔。
5.  梯度稀释问题：将模版10倍稀释后，每个梯度CT值相差要控制在3.3-3.5个循环之间。
如果CT值超过30个循环以后，就不适宜做梯度稀释了，因为这个时候浓度太低，定量本来就不准，所以梯度稀释结果不能用作参考的。
6.  标准曲线：通常有些人做很多标本，要用不同的pcr反应板，不能同时一次进行，这时每个反应板最好做标准曲线，斜率相差小于0.1，结果可认为具有可比性。且扩增斜率要在-3.6到-3.1之间结果最好。当然了，这个时候因为每个板都做标准曲线了，分析的时候既可以用detadetaCT法，也可以用双标准曲线法了。
7.  如何理解标本做复孔的问题：原来我一直都不理解标本做复孔的问题，就是不知道怎么做，我以为是一个标本，在不同的反应板里做3次，取平均结果，同一个实验室里也没人做过的，后来问同学，才知道，在这里谢谢她了。
过程如下：20ul体系，比如说你要做10个标本，每个标本要做3个复孔，就先准备10*3+大约5个标本的母液（含酶、realtimepcr的试剂等，但不包括模板），然后准备10个500ul的pcr管，每个分装60ul。然后在分装好的母液中加入3ul的模版，混匀后再分装20ul到3个realtime反应孔中，这样就说传说的3个复孔了，避免了不同批次、加样等等误差。
注：这里考虑浪费，所以母液分装时多准备了；且分装模板混合物时转速不要太大，基本上1000-1500几秒就够了，要不然酶会下沉，我通常是混匀两次离心两次再分装。
8.  关于结果分析：我想所有做过realtimepcr的人都熟悉那个很复杂的公式吧。又samplA又samplB 又 target 又reference我当时就苦苦考虑了我的实验当中到底哪个充当reference的角色，偶尔在论坛上看到一篇文献，具体我也忘了，大体就是说如果是讨论两组时间的表达量差异，那个reference是可以不要的，指数直接是同一个标本的-（目标基因-管家基因的ct）就可以了。

9. 关于realtimepcr优化的问题：关于这个问题真是浪费我不少钱了，现在我把我的秘密告诉大家吧，呵呵，
9.1  先跑普通PCR看看你的引物有没有问题，正常的产物能不能出来。一切正常的话就上realtime pcr吧。
9.2  realtime pcr时所有反应的ct值必须控制在12-30个循环之间，结果才有可比性。我的管家基因ct值已经到了13-17之间了，但是我目标基因已经在30个循环之外了，表达量很低，询问了roche的工程师，他说我的管家基因表达量太高了，最好换下别的管家基因，或是提高目标基因的表达量，我想他是对的。
9.3  关于控制非特异性扩增的问题，除了看溶解曲线之外，另外一个方法是我非常推崇的，我现在还很后悔我没有早早的用这个方法，以至于浪费了很多钱，那就是采用realtime pcr产物去跑胶2.5%琼脂糖，我上样10ul，好的反应真是一点杂带没有，不好的话杂带好多，呜呜呜，这个方法真是很灵敏的，根据结果乖乖的调整你的反应条件吧，或者就是重新选引物了。不过我看ABI7000的仪器说明，好像说是你要是用PCR产物跑胶的话不能做溶解曲线，不知道是不是这样，我没研究过。
10  引物长度 sybr green的片段长度最好不要超过300bp，但是我做了580bp的结果和300bp左右的结果差不多。Taqman的话估计得150bp以下不能太高了。2010.2.8应iamxetu提醒修改。
11  关于标准物的问题我原来还想我到底去哪里找标准物好呢，真是个大问题，最后问了ROCHE的工程师，他说你的实验只是相对定量，只要随便选个样品作为标准品都可以的，我用了他的方法。不过选标准品的时候要注意选个表达量高的哦，要不然你最高浓度的时候已经20ct了，再稀释4个浓度，低浓度到30ct以外就不好了。
12  总RNA被DNA污染的问题：我提取的是细菌总RNA，DNA污染真是不可避免，最后用了宝xx的DNase1，按照它的说明书进行，结果很麻烦，我做的时候常常让我崩溃，后来我看了别的厂家的，比如说Axx，方法简单多了，别的网友可以考虑下，不过也要考虑钱的问题了。
13  凡是做溶解曲线的realtime pcr反应，在pcr扩增完成以后会看见扩增曲线最后有一个下降的曲线，不要大惊小怪，因为仪器要接着做溶解曲线了，原理我不懂，但是这是正常的。
14  溶解曲线的杂峰判断网友的经验，在70-75度左右出现的杂峰一般为引物二聚体。
15.2010.2.8加上稀释CDNA: 我稀释cDNA的时候犯了一个严重的错误，说出来也许对网友有所帮助。我逆转录了500ng的总RNA20ul,cDNA的浓度应该是25ng/ul，但是我当成是500ng/ul的浓度稀释了，稀释成5ng/ul的浓度，稀释完了以后我就先做内参，结果正常，但是做目标基因的时候发现不对了，CT值都在35以上，开始找原因，才知道稀释错了。当时好郁闷，浪费了好多easy dilution and sybr green realtime pcr试剂，浪费了很多钱，而且重新买试剂也耽误了好长时间，写在这里是提醒网友们做的时候千万别弄错了。
好了，我想说的问题就这些了，当时真的是很困扰我的问题，里面的经验大多我从网上看到的然后自己实践的，要是哪里说的不对，或是有更好的方法给我指出来吧。我也想学习学习。谢谢了。

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