| 查看: 4258 | 回复: 8 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
shiliyusly新虫 (小有名气)
|
[求助]
QPCR之 扩增效率
|
||
|
大家好！之前在坛里发过帖子对于QPCR学到很多，现在总结就是扩增效率很重要。 一直有2个问题基因在折磨着我，目前我还没到绝望到换引物的地步，所以还是想先摸下优化条件，因为我引物设计也不熟练，实在是没有把握能设计个新的好的。 一个是内标基因ACT，普通PCR摸的退火温度是47度，QPCR上做了47度，60度，65度并且引物减半的，图如下： 现在想请教下高手ACT接下去该怎么摸呢？ 另一个基因是F3'H,溶解曲线有个小峰，空白对照都有小峰，并且峰型和样品的差不多，两个峰。 之前60度二步法扩增效率80%，后来我用52度三步法扩增效率达到98%，线性拟合度达0.99多，想问这样是不是OK呢，顾虑就是溶解曲线有小峰，但是空白对照就是有小峰的，空白和最低稀释度的峰型基本一样。有点奇怪。F3'H溶解曲线如下第2个图： 还麻烦高手指点下啊，谢谢谢谢！！！  3个ACT比较图.jpg  2Z75(V$JY09JG]IP%`PLWZE.jpg |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 QPCR 问题简答 |
» 本帖@通知
» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有287人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 相对定量中怎样提高扩增效率
已经有5人回复
- real-time PCR相对定量2 -△△CT法中用来判断扩增效率的标准曲线怎么制作？
已经有8人回复
- 基因引物与内参引物
已经有14人回复
- 各位做qPCR的大侠看过来～～～～～～
已经有8人回复
- Realtime PCR 内参与目的基因问题
已经有11人回复
- 荧光定量pcr溶解曲线好几个峰，但是电泳只有一条目的条带，怎么回事
已经有5人回复
- 有关RT-PCR中的一些困扰的问题
已经有7人回复
- RT-qPCR实验问题
已经有23人回复
- 着急！RT-PCR扩增效率低，情况很诡异，求助高手帮忙指点
已经有12人回复
- 关于qPCR的几个问题，求解答
已经有3人回复
- 请教RT-PCR 扩增问题
已经有8人回复
- 一个关于qPCR标准曲线的问题。谢谢！
已经有12人回复
- Real-Time PCR加样过程中的那些细节
已经有19人回复
- 荧光定量PCR扩增效率怎么做？？？？我要被逼疯了
已经有17人回复
- 荧光定量扩增效率低怎么办
已经有3人回复
- PCR试剂进行大批量配制分装，却出现了扩增效率低下的结果。
已经有11人回复
- 帮我看看这个溶解qPCR曲线
已经有6人回复
- 【求助/交流】为什么PCR扩增产物片段长度比设计时的要长很多？
已经有10人回复
- 【求助/交流】实时荧光定量PCR的扩增效率低该如何改进？
已经有5人回复
shiliyusly
新虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 265.4
- 散金: 17
- 红花: 1
- 帖子: 138
- 在线: 71.5小时
- 虫号: 1434769
- 注册: 2011-10-10
- 专业: 食品科学基础
4楼2013-01-28 10:05:41
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+3, ★有帮助 2013-01-28 10:05:52
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-01-29 08:30:42
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+3, ★有帮助 2013-01-28 10:05:52
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-01-29 08:30:42
|
从F3'H扩增来看，小峰多半是引物二聚体。你说的空白对照峰型和样品差不多是什么意思？你指空白对照也能有扩增吗？空白对照出现标准峰的话一般是指样品有基因组DNA污染。如果我没记错，你做的是杨梅？你引物设计的时候是否跨越了内含子？如果有跨内含子，基因组DNA扩增出来的峰与cDNA的峰应该是不同的。空白对照往往容易出现熔解温度较低的峰，那是引物二聚体造成的，因为缺少特异扩增，引物二聚体形成会比样品更严重一些。你的这个情况，只能说引物不好。 有一点要说明的是，目标基因和内参基因扩增时的退火温度最好选取一致。因为做定量时需要它们在同样的条件下扩增。为什么要这么做你大概也是知道的。荧光强度随着温度升高是衰减的，这个可以从熔解曲线上看。曲线一直是下降的，当熔解产物时，有很陡的slop出现。所以，做很多基因定量时，引物设计方面除了要考虑特异性和高阶结构以外，还要考虑退火温度大致相同。 从内参的三个图来看，内参的引物的问题似乎更大。退火温度高时CT数大是正常趋势，但是图上熔解温度高于80°C的有两个峰。退火温度越低，前面的峰越大。这个说明很可能引物有非特异扩增。如果你的内标出现这种问题，我看换引物是最佳选择。 |
2楼2013-01-27 03:38:38
shiliyusly
新虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 265.4
- 散金: 17
- 红花: 1
- 帖子: 138
- 在线: 71.5小时
- 虫号: 1434769
- 注册: 2011-10-10
- 专业: 食品科学基础
3楼2013-01-28 09:53:33
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-01-29 08:31:00
shiliyusly: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-01-29 09:56:03
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-01-29 08:31:00
shiliyusly: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-01-29 09:56:03
|
正常的空白应该没有扩增，什么都没有，读不到CT，扩增曲线是在baseline。当然，这是非常理想的情况，有时候是可以看到空白的扩增曲线稍微有些抬头的，但整个荧光水平非常低，未到达检测限。 是否该用F3'H引物你只有自己决定了。反正不是理想的引物。对于ACT，你想摸条件也是可以的。但我觉得吧，你应该在摸条件的同时也订一下新的引物。 引物合成一般不是很慢吧，你对自己设计引物信心不足这个我可以理解。谁都有这个阶段。尤其是做定量的引物，不是能P出来就一定好用的。一般是这样的，反正引物也不贵，可以对一个基因设计两三对引物，选效果好的一对做实验。 |
5楼2013-01-29 01:14:58
