应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » QPCR之引物设计(二)
51/1返回列表
查看: 2818  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] QPCR之引物设计(二)

大家好，我做QPCR扩增效率的时候遇到一个基因，之前测得的CT值是30左右，退火温度是54度，溶解曲线如图1。
我现在补做扩增效率，体系试剂什么都是一样的，可是测得的相同样品的CT值基本都在33左右我试过51-57度退火温度，扩增效率很低，连拟合度都不好，CT值比较低，我用的是2倍稀释度，怕是稀释不准，后来重复了几次，但结果依然不是很好。溶解曲线如图2。
大家看这是什么原因呢，感觉引物质量是还好吧？是要换引物吗？

图2.jpg

图1.jpg
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验

» 本帖@通知

@cicelyzh

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-03-06 16:42:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+1 2013-03-07 13:15:09
循环数偏大，可以通过稍微调整一下DNA浓度调整。
做扩增效率需要用质粒DNA作模板，如果SLOPE可以，但是扩增效率太低，那就需要换引物。
赞一下 回复此楼
3楼2013-03-07 09:51:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+2 2013-03-07 13:15:03
同一cDNA经过冻化CT值会有一点变大。如果做相对定量的话问题不是很大，因为内参的CT也会变大。至于你说的温度梯度，一般是考虑在不同退火温度下的特异性和扩增效率。你的熔解曲线说明产物单一，特异性是不错的。至于扩增效率，要根据标准样品的CT来计算。
赞一下 回复此楼
2楼2013-03-07 09:48:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-07 09:48:56
同一cDNA经过冻化CT值会有一点变大。如果做相对定量的话问题不是很大，因为内参的CT也会变大。至于你说的温度梯度，一般是考虑在不同退火温度下的特异性和扩增效率。你的熔解曲线说明产物单一，特异性是不错的。至于 ...

我做扩增效率是把原浓度模板稀释2倍，做4个梯度，再根据浓度和CT值做的曲线，仪器给出的扩增效率值不高
赞一下 回复此楼
4楼2013-03-07 13:13:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-07 09:48:56
同一cDNA经过冻化CT值会有一点变大。如果做相对定量的话问题不是很大，因为内参的CT也会变大。至于你说的温度梯度，一般是考虑在不同退火温度下的特异性和扩增效率。你的熔解曲线说明产物单一，特异性是不错的。至于 ...

还有哦，我其他基因也是相同的方法，他们的CT值和之前相比就没什么区别的，这是为什么
赞一下 回复此楼
5楼2013-03-07 13:14:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐 +8 Ncdx123456 2026-03-13 9/450 2026-03-18 14:40 by haxia
[考研] 302求调剂 +10 呼呼呼。。。。 2026-03-17 10/500 2026-03-18 12:45 by Linda Hu
[考研] 288求调剂，一志愿华南理工大学071005 +4 ioodiiij 2026-03-17 4/200 2026-03-18 12:36 by Linda Hu
[考研] 0703化学调剂 +4 pupcoco 2026-03-17 7/350 2026-03-18 12:14 by djl2006
[考研] 265求调剂 +3 梁梁校校 2026-03-17 3/150 2026-03-18 09:12 by zhukairuo
[考研] 326求调剂 +5 上岸的小葡 2026-03-15 6/300 2026-03-17 17:26 by ruiyingmiao
[考研] 085601求调剂 +4 Du.11 2026-03-16 4/200 2026-03-17 17:08 by ruiyingmiao
[考研] 梁成伟老师课题组欢迎你的加入 +8 一鸭鸭哟 2026-03-14 10/500 2026-03-17 15:07 by 一鸭鸭哟
[考研] 中科院材料273求调剂 +4 yzydy 2026-03-15 4/200 2026-03-16 15:59 by Gaodh_82
[考研] 326求调剂 +3 mlpqaz03 2026-03-15 3/150 2026-03-16 07:33 by Iveryant
[考研] 求老师收留调剂 +4 jiang姜66 2026-03-14 5/250 2026-03-15 20:11 by Winj1e
[考研] 0856专硕279求调剂 +5 加油加油！? 2026-03-15 5/250 2026-03-15 11:58 by 2020015
[考研] 一志愿哈工大材料324分求调剂 +5 闫旭东 2026-03-14 5/250 2026-03-14 14:53 by 木瓜膏
[考研] 材料080500调剂求收留 +3 一颗meteor 2026-03-13 3/150 2026-03-14 10:54 by peike
[考研] 311求调剂 +3 冬十三 2026-03-13 3/150 2026-03-13 20:41 by JourneyLucky
[硕博家园] 085600 260分求调剂 +3 天空还下雨么 2026-03-13 5/250 2026-03-13 18:46 by 天空还下雨么
[考研] 328化工专硕求调剂 +4 。，。，。，。i 2026-03-12 4/200 2026-03-13 14:44 by JourneyLucky
[考研] 材料301分求调剂 +5 Liyouyumairs 2026-03-12 5/250 2026-03-13 14:42 by JourneyLucky
[考博] 福州大学杨黄浩课题组招收2026年专业学位博士研究生，2026.03.20截止 +3 Xiangyu_ou 2026-03-12 3/150 2026-03-13 09:36 by duanwu655
[考研] 321求调剂（食品/专硕） +3 xc321 2026-03-12 6/300 2026-03-13 08:45 by xc321
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭