应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » QPCR之引物设计(二)
51/1返回列表
查看: 3477  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] QPCR之引物设计(二)

大家好，我做QPCR扩增效率的时候遇到一个基因，之前测得的CT值是30左右，退火温度是54度，溶解曲线如图1。
我现在补做扩增效率，体系试剂什么都是一样的，可是测得的相同样品的CT值基本都在33左右我试过51-57度退火温度，扩增效率很低，连拟合度都不好，CT值比较低，我用的是2倍稀释度，怕是稀释不准，后来重复了几次，但结果依然不是很好。溶解曲线如图2。
大家看这是什么原因呢，感觉引物质量是还好吧？是要换引物吗？

图2.jpg

图1.jpg
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验

» 本帖@通知

@cicelyzh

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-03-06 16:42:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
shiliyusly: 金币+3 2013-03-09 15:00:31
shiliyusly: 金币+2, 2 2013-03-12 21:40:18
引用回帖:
9楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-03-09 09:13:37
最好的一次退火温度是62%，但是拟合度只有0.896，后来我模板有重新稀释还换了一个但是还是不好。...

差不多有90%，应该能凑合着用。实在不喜欢就换引物试试。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

shiliyusly
10楼2013-03-09 11:09:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+2 2013-03-07 13:15:03
同一cDNA经过冻化CT值会有一点变大。如果做相对定量的话问题不是很大，因为内参的CT也会变大。至于你说的温度梯度，一般是考虑在不同退火温度下的特异性和扩增效率。你的熔解曲线说明产物单一，特异性是不错的。至于扩增效率，要根据标准样品的CT来计算。
赞一下 回复此楼
2楼2013-03-07 09:48:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+1 2013-03-07 13:15:09
循环数偏大，可以通过稍微调整一下DNA浓度调整。
做扩增效率需要用质粒DNA作模板，如果SLOPE可以，但是扩增效率太低，那就需要换引物。
赞一下 回复此楼
3楼2013-03-07 09:51:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-07 09:48:56
同一cDNA经过冻化CT值会有一点变大。如果做相对定量的话问题不是很大，因为内参的CT也会变大。至于你说的温度梯度，一般是考虑在不同退火温度下的特异性和扩增效率。你的熔解曲线说明产物单一，特异性是不错的。至于 ...

我做扩增效率是把原浓度模板稀释2倍，做4个梯度，再根据浓度和CT值做的曲线，仪器给出的扩增效率值不高
赞一下 回复此楼
4楼2013-03-07 13:13:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 TZqyNTBa07NP 2026-11-13 4/200 2026-11-15 09:57 by xSrQNSSjcgoX
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 SX5mJmPWDfOO 2026-11-13 4/200 2026-11-15 07:34 by xSrQNSSjcgoX
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 uKOSCocCb6Fm 2026-11-12 7/350 2026-11-15 03:43 by xSrQNSSjcgoX
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 uKOSCocCb6Fm 2026-11-12 9/450 2026-11-15 02:04 by xSrQNSSjcgoX
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 FChKX8meu1ds 2026-11-09 8/400 2026-11-14 22:04 by Equinoxhua
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +6 czAiolzR0IJC 2026-11-10 6/300 2026-11-12 16:55 by zzy933268
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 TgvkbZZl9tqB 2026-11-11 4/200 2026-11-12 12:28 by ECLTXnJnRSXf
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 cdqGD6ftHmbl 2026-11-11 4/200 2026-11-12 12:26 by ECLTXnJnRSXf
[基金申请] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 Z7qfCsdIiD1T 2026-11-10 7/350 2026-11-12 11:33 by HajghKOMynmz
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +5 Z7qfCsdIiD1T 2026-11-10 8/400 2026-11-12 11:22 by HajghKOMynmz
[基金申请] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 czAiolzR0IJC 2026-11-10 9/450 2026-11-12 11:11 by HajghKOMynmz
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 G2rhSvqvhNzl 2026-11-10 6/300 2026-11-12 10:49 by HajghKOMynmz
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 C6CRn66RYYXS 2026-11-10 8/400 2026-11-12 10:27 by HajghKOMynmz
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 C6CRn66RYYXS 2026-11-10 6/300 2026-11-12 10:16 by HajghKOMynmz
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +7 FChKX8meu1ds 2026-11-09 12/600 2026-11-12 09:43 by HajghKOMynmz
[考研] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +8 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 12/600 2026-11-12 09:32 by HajghKOMynmz
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +7 0TEMgxdT1eIw 2026-11-09 9/450 2026-11-12 09:24 by HajghKOMynmz
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 7/350 2026-11-12 05:19 by 9fOTqj074tIg
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 9/450 2026-11-12 04:57 by 9fOTqj074tIg
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 FChKX8meu1ds 2026-11-09 6/300 2026-11-11 17:03 by TgvkbZZl9tqB
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭