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PCR引物设计问题，求教大神~
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本人新手一枚，求教各位大神问题。 我现在想通过一些乳酸菌16S序列设计通用引物，求大神告知。现在的主要问题是：（1）我现在有40个16S序列，保守序列必须是每个碱基都必须一样么？保守序列必须是连续的么？在两个保守序列上分别设计上，下游引物可不可以？1500左右的碱基序列，有好几个保守序列该如何取舍，还是都需要尝试设计引物？（2）引物设计原则中说，上下游引物GC含量不应差距太大，差多少算是大呢？（3）听说引物设计完了还需要跟原序列对比，比较什么？如何比较？ 本人纯新手，乱七八糟问了一大堆......如有耐心高手都好好讲讲更是不胜感激...... |
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Davidzjy
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不清楚你的研究目的是什么？你设计通用引物的目的是什么？感觉没表述清楚，看完还是不知道什么意思。 普通的PCR引物设计并不难。两条引物的GC含量最好是控制在40%-60%之间，其实也没有那么严格的，不要有太多的错配，和发夹结构就可以。可以用引物设计软件评一下分数，大概了解一下错配和发夹结构的情况。DNA star和Primer 5都可以。 至于你说的引物设计完之后要跟原序列比对，其实还是为了避免错配现象的发生，看看是否有可能扩增出杂带。如果引物跟原序列不只一处可以发生匹配，这种引物做PCR，非常容易扩出杂带，也就是除了你的目的条带，还可能出现好几条你并不需要的条带。 引物设计的退火温度不要设计的太低，我觉得54度到60度之间效果还都不错的。至于一些设计的细节，光说也说不清楚，设计好之后，最好是给师兄师姐看一下，看可否用。如果是新手，完全没有做过，光靠自己摸索，还是挺耽误时间的，其实问一下懂的人，手把手教你一下，很快就学会了。 |
4楼2013-11-26 15:56:24
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1949stone
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