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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 反向PCR遇到的问题 求大神大牛们的指点！
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芳芳在考研

银虫 (小有名气)

[求助] 反向PCR遇到的问题 求大神大牛们的指点！

反向pcr做了两个月，实验步骤，提基因组，酶切消化，T4连接，纯化产物，PCR，之前p出来都是糊带，最近发现T4连接后浓度就已经变得很低很低，几乎没有，纯化后就更少了。200微升连接体系。用的Sau3A1酶切，37度过夜，连接是16度，至少五个小时。十个小时的也连过，但是都是一样的浓度低。酶切的时候是取的10微升DNA去切，50微升体系，过夜后65度灭活20分钟，然后连接，取的是12.5微升酶切产物。
   希望得到各位的指点，实验新手急需帮助啊！
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努力。。。
1楼 2013-11-06 21:50:02
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芳芳在考研

银虫 (小有名气)
不能沉啊，求助求助！！！！！11！
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努力。。。
2楼2013-11-06 21:54:43
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-07 11:30:37
芳芳在考研: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-11-07 13:20:15
扩旁侧未知序列？多提点基因组DNA，全部酶切，连接，20微升太少了。适当的用乙醇沉淀提高DNA浓度在做下一个步骤，比如酶切前，连接前，PCR前都可以醇沉一下提高浓度，用小一点的反应体系。连接完，即使少，也可能可以PCR。PCR不好的话，检查一下引物，推荐用两对引物做反向巢式PCR。
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为什么
3楼2013-11-07 08:26:28
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芳芳在考研

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 547star at 2013-11-07 08:26:28
扩旁侧未知序列？多提点基因组DNA，全部酶切，连接，20微升太少了。适当的用乙醇沉淀提高DNA浓度在做下一个步骤，比如酶切前，连接前，PCR前都可以醇沉一下提高浓度，用小一点的反应体系。连接完，即使少，也可能可 ...

全部酶切？那我取50微升DNA加1微升酶还有25微升BUFFER去酶切行吗？再乙醇沉淀之后，然后再把酶切产物75微升全部用来连接？
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努力。。。
4楼2013-11-07 08:47:29
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547star

木虫 (著名写手)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-07 11:30:44
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4楼: Originally posted by 芳芳在考研 at 2013-11-07 08:47:29
全部酶切？那我取50微升DNA加1微升酶还有25微升BUFFER去酶切行吗？再乙醇沉淀之后，然后再把酶切产物75微升全部用来连接？...

要25微升这么多，多少X的buffer啊？一般10x的buffer的话用6微升，50微升DNA，3-4微升内切酶，总体积60微升，供参考。酶切完，部分电泳，怎么也剩50微升吧，因为是Sau3A1酶切，就不做胶回收了，直接加热失活后用试剂盒纯化或2倍乙醇沉淀，再溶解于20-30微升纯净水，进行30微升左右的连接，连接产物进行PCR。
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为什么
5楼2013-11-07 11:11:06
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芳芳在考研

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 547star at 2013-11-07 11:11:06
要25微升这么多，多少X的buffer啊？一般10x的buffer的话用6微升，50微升DNA，3-4微升内切酶，总体积60微升，供参考。酶切完，部分电泳，怎么也剩50微升吧，因为是Sau3A1酶切，就不做胶回收了，直接加热失活后用试剂 ...

谢谢啊，恩，早上做的60微升体系酶切，但是酶加了1微升，还有，是把剩下的50多微升全部来连接吗？
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努力。。。
6楼2013-11-07 13:49:01
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 芳芳在考研 at 2013-11-07 13:49:01
谢谢啊，恩，早上做的60微升体系酶切，但是酶加了1微升，还有，是把剩下的50多微升全部来连接吗？...

留着也没用的，做不出来宁可全部重来。前面体系大点，最后用的时候浓度才够高。PCR的模板，浓度高，纯度高，才容易成功。
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为什么
7楼2013-11-07 17:19:45
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547star

木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-08 10:43:31
Sau3A1酶切最好是做不同时间的，就是在切割不同时间后取出热失活，或者先对同一批基因组DNA进行预实验，看看切多久合适。酶切过夜容易把基因组DNA切成碎片，做反向PCR的时候，得不到PCR产物，或者PCR产物太小，达不到研究目的。
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为什么
8楼2013-11-08 09:35:33
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