应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 反向PCR遇到的问题 求大神大牛们的指点！
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
81/1返回列表
查看: 1575  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

芳芳在考研

银虫 (小有名气)

[求助] 反向PCR遇到的问题 求大神大牛们的指点！

反向pcr做了两个月，实验步骤，提基因组，酶切消化，T4连接，纯化产物，PCR，之前p出来都是糊带，最近发现T4连接后浓度就已经变得很低很低，几乎没有，纯化后就更少了。200微升连接体系。用的Sau3A1酶切，37度过夜，连接是16度，至少五个小时。十个小时的也连过，但是都是一样的浓度低。酶切的时候是取的10微升DNA去切，50微升体系，过夜后65度灭活20分钟，然后连接，取的是12.5微升酶切产物。
   希望得到各位的指点，实验新手急需帮助啊！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
努力。。。
1楼 2013-11-06 21:50:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

芳芳在考研

银虫 (小有名气)
不能沉啊，求助求助！！！！！11！
赞一下 回复此楼
努力。。。
2楼2013-11-06 21:54:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-07 11:30:37
芳芳在考研: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-11-07 13:20:15
扩旁侧未知序列？多提点基因组DNA，全部酶切，连接，20微升太少了。适当的用乙醇沉淀提高DNA浓度在做下一个步骤，比如酶切前，连接前，PCR前都可以醇沉一下提高浓度，用小一点的反应体系。连接完，即使少，也可能可以PCR。PCR不好的话，检查一下引物，推荐用两对引物做反向巢式PCR。
赞一下 回复此楼
为什么
3楼2013-11-07 08:26:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

芳芳在考研

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 547star at 2013-11-07 08:26:28
扩旁侧未知序列？多提点基因组DNA，全部酶切，连接，20微升太少了。适当的用乙醇沉淀提高DNA浓度在做下一个步骤，比如酶切前，连接前，PCR前都可以醇沉一下提高浓度，用小一点的反应体系。连接完，即使少，也可能可 ...

全部酶切？那我取50微升DNA加1微升酶还有25微升BUFFER去酶切行吗？再乙醇沉淀之后，然后再把酶切产物75微升全部用来连接？
赞一下 回复此楼
努力。。。
4楼2013-11-07 08:47:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

547star

木虫 (著名写手)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-07 11:30:44
引用回帖:
4楼: Originally posted by 芳芳在考研 at 2013-11-07 08:47:29
全部酶切？那我取50微升DNA加1微升酶还有25微升BUFFER去酶切行吗？再乙醇沉淀之后，然后再把酶切产物75微升全部用来连接？...

要25微升这么多，多少X的buffer啊？一般10x的buffer的话用6微升，50微升DNA，3-4微升内切酶，总体积60微升，供参考。酶切完，部分电泳，怎么也剩50微升吧，因为是Sau3A1酶切，就不做胶回收了，直接加热失活后用试剂盒纯化或2倍乙醇沉淀，再溶解于20-30微升纯净水，进行30微升左右的连接，连接产物进行PCR。
赞一下(1人) 回复此楼
为什么
5楼2013-11-07 11:11:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

芳芳在考研

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 547star at 2013-11-07 11:11:06
要25微升这么多，多少X的buffer啊？一般10x的buffer的话用6微升，50微升DNA，3-4微升内切酶，总体积60微升，供参考。酶切完，部分电泳，怎么也剩50微升吧，因为是Sau3A1酶切，就不做胶回收了，直接加热失活后用试剂 ...

谢谢啊，恩，早上做的60微升体系酶切，但是酶加了1微升，还有，是把剩下的50多微升全部来连接吗？
赞一下 回复此楼
努力。。。
6楼2013-11-07 13:49:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 芳芳在考研 at 2013-11-07 13:49:01
谢谢啊，恩，早上做的60微升体系酶切，但是酶加了1微升，还有，是把剩下的50多微升全部来连接吗？...

留着也没用的，做不出来宁可全部重来。前面体系大点，最后用的时候浓度才够高。PCR的模板，浓度高，纯度高，才容易成功。
赞一下 回复此楼
为什么
7楼2013-11-07 17:19:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

547star

木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-08 10:43:31
Sau3A1酶切最好是做不同时间的，就是在切割不同时间后取出热失活，或者先对同一批基因组DNA进行预实验，看看切多久合适。酶切过夜容易把基因组DNA切成碎片，做反向PCR的时候，得不到PCR产物，或者PCR产物太小，达不到研究目的。
赞一下 回复此楼
为什么
8楼2013-11-08 09:35:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 芳芳在考研 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 081700化学工程与技术 一志愿中海洋 323 求调剂学校 +17 披星河 2026-04-03 17/850 2026-04-06 12:27 by 考研学校招点人
[考研] 求调剂 +5 wos666 2026-04-03 5/250 2026-04-06 10:13 by 蓝云思雨
[考研] 求调剂 +5 chenxrlkx 2026-04-05 7/350 2026-04-06 07:54 by houyaoxu
[考研] 315求调剂 +14 欣喜777 2026-04-04 15/750 2026-04-06 06:25 by houyaoxu
[考研] 找调剂 +10 楚乔乔 2026-04-01 10/500 2026-04-05 22:19 by syh9288
[考研] 377求调剂 +6 by.ovo 2026-04-05 6/300 2026-04-05 22:18 by dongzh2009
[考研] 材料专硕322分 +10 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-04 10/500 2026-04-05 21:22 by 学员8dgXkO
[考研] 070300化学求调剂 +17 小黄鸭宝 2026-03-30 17/850 2026-04-05 12:03 by 宁馨哈哈
[考研] 一志愿北京化工大学，初试成绩350求调剂 +9 沿岸?贝壳 2026-04-04 14/700 2026-04-05 01:09 by 沿岸?贝壳
[考研] 295求调剂 +4 A你好研究生 2026-04-04 5/250 2026-04-04 22:46 by yu221
[考研] 359求调剂 +7 hhhhaaaa$ 2026-04-04 7/350 2026-04-04 18:49 by imissbao
[考研] 一志愿沪985，326分求调剂 +3 刘墨墨 2026-04-03 3/150 2026-04-04 11:16 by 悲伤的芋头
[考研] 专硕085601求调剂 +7 suyifei 2026-04-03 8/400 2026-04-03 14:00 by 欣喜777
[考研] 085600 295分求调剂 +19 W55j 2026-03-30 23/1150 2026-04-03 09:53 by 千千运气
[考研] 085600，320分求调剂 +6 大馋小子 2026-04-02 6/300 2026-04-02 21:54 by dongzh2009
[考研] 0856材料与化工调剂，339 +14 10213207 2026-03-31 14/700 2026-04-02 21:01 by 1104338198
[考研] 材料调剂 +11 一样YWY 2026-03-31 11/550 2026-04-01 22:25 by zhouyuwinner
[考研] 085600，321分求调剂 +13 大馋小子 2026-03-31 13/650 2026-04-01 12:35 by chemdavid
[考研] 一志愿中海洋320化学工程与技术学硕求调剂 +8 披星河 2026-03-30 8/400 2026-03-31 08:53 by lbsjt
[考研] 一志愿食品科学与工程083200求调剂 +4 XQTJZ 2026-03-30 4/200 2026-03-31 04:10 by fmesaito
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭