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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于反向PCR 和测序结果的拼接
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Silencess

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于反向PCR 和测序结果的拼接已有6人参与

最近在做反向PCR··   
用的HaeIII酶切··  弥散性条带 回收800-2000bp 的片段，纯化，用2ng/ul 的量进行自环化。。但是之后的反向PCR  除了第一次跑出来一个，后面一直跑不出啊。。。

我想问··· 如果反向PCR 的结果依然是弥散带，是不是可以反复调整下体系继续做呢？ 还是如果跑不出来就需要重新进行自环化？ 不知道大家反向的PCR 的成功率一般高么？ 有什么好的经验么？

还有就是 反向PCR 测序的结果出来以后，应该如何拼接呢？ 如何找到片段的连接点？

求高人赐教·· 不甚感激！
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繁花似錦，年華散盡。
1楼2010-08-14 13:57:07
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ben1147

木虫 (正式写手)
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lstt09nk(金币+2):鼓励交流~~ 2010-08-14 15:44:08
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长，自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了，肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧，至少五种以上

酶切充分一点，不用回收，产物直接纯化后稀释做连接

测序结果里面肯定有一个相应切点的，切点两边序列分别做反向互补，就分别是已知片段上、下游的序列

[ Last edited by ben1147 on 2010-8-14 at 14:04 ]
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2楼2010-08-14 14:03:01
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Silencess

金虫 (小有名气)
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Originally posted by linxi8579 at 2010-08-14 15:43:36:

做之前不是用Southern确定适当的酶切位点吗，选择环化后大小合适的位点。为什么要用多个内切酶。并且我想问一下这个反向PCR和Walking \RACE 有什么区别啊？多谢了。

啊·· 我之前做的巢式PCR 是不需要酶切的，直接基因组DNA 扩增就行~
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4楼2010-08-14 20:16:44
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ben1147

木虫 (正式写手)
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Originally posted by Silencess at 2010-08-14 20:16:44:


啊·· 我之前做的巢式PCR 是不需要酶切的，直接基因组DNA 扩增就行~

TAIL-PCR可以扩增未知序列，又不用环化，可以直接扩增

简并引物序列都是现成的

但是感觉不如I-PCR成功率高，三轮PCR也麻烦一些
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6楼2010-08-14 22:06:05
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
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Originally posted by ben1147 at 2010-08-14 14:03:01:
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长，自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了，肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧，至少五种以上

酶切充分一点，不 ...

做之前不是用Southern确定适当的酶切位点吗，选择环化后大小合适的位点。为什么要用多个内切酶。并且我想问一下这个反向PCR和Walking \RACE 有什么区别啊？多谢了。
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3楼2010-08-14 15:43:36
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Silencess

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-08-14 14:03:01:
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长，自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了，肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧，至少五种以上

酶切充分一点，不 ...

啊··   回收就是想避免 扩增环化片段过长吧··   

感觉环化好随机呀。。。 头疼
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繁花似錦，年華散盡。
5楼2010-08-14 20:19:02
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
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Originally posted by Silencess at 2010-08-14 20:16:44:


啊·· 我之前做的巢式PCR 是不需要酶切的，直接基因组DNA 扩增就行~

那么反向PCR与Walking 和RACE有什么区别啊？
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7楼2010-08-16 11:27:09
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
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1楼: Originally posted by Silencess at 2010-08-14 13:57:07:
最近在做反向PCR··   
用的HaeIII酶切··  弥散性条带 回收800-2000bp 的片段，纯化，用2ng/ul 的量进行自环化。。但是之后的反向PCR  除了第一次跑出来一个，后面一直跑不出啊。。。

我想问··· 如果反 ...

请教楼主一个问题：环化后回收不到DNA,离心后看不到离心管里有东西啊，遇到过这样的现象吗？
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8楼2011-08-15 22:12:40
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dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫
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楼主 现在反向PCR做出来了没有呢？
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好好学习，天天向上
9楼2012-12-12 15:18:18
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wangjiaxing1

新虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by ben1147 at 2010-08-14 22:06:05
TAIL-PCR可以扩增未知序列，又不用环化，可以直接扩增

简并引物序列都是现成的

但是感觉不如I-PCR成功率高，三轮PCR也麻烦一些...

请问，具体的TAIL-PCR步骤、引物怎么设计，之前也看过这方面资料，但是不是很懂，求教。
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10楼2013-09-12 10:09:05
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