应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于反向PCR 和测序结果的拼接
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
111/2返回列表12下一页
查看: 2509  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Silencess

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于反向PCR 和测序结果的拼接 已有6人参与

最近在做反向PCR··   
用的HaeIII酶切··  弥散性条带 回收800-2000bp 的片段，纯化，用2ng/ul 的量进行自环化。。但是之后的反向PCR  除了第一次跑出来一个，后面一直跑不出啊。。。

我想问··· 如果反向PCR 的结果依然是弥散带，是不是可以反复调整下体系继续做呢？ 还是如果跑不出来就需要重新进行自环化？ 不知道大家反向的PCR 的成功率一般高么？ 有什么好的经验么？

还有就是 反向PCR 测序的结果出来以后，应该如何拼接呢？ 如何找到片段的连接点？

求高人赐教·· 不甚感激！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
繁花似錦，年華散盡。
1楼 2010-08-14 13:57:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):鼓励交流~~ 2010-08-14 15:44:08
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长，自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了，肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧，至少五种以上

酶切充分一点，不用回收，产物直接纯化后稀释做连接

测序结果里面肯定有一个相应切点的，切点两边序列分别做反向互补，就分别是已知片段上、下游的序列

[ Last edited by ben1147 on 2010-8-14 at 14:04 ]
赞一下(3人) 回复此楼
2楼2010-08-14 14:03:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Silencess

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-08-14 15:43:36:

做之前不是用Southern确定适当的酶切位点吗，选择环化后大小合适的位点。为什么要用多个内切酶。并且我想问一下这个反向PCR和Walking \RACE 有什么区别啊？多谢了。

啊·· 我之前做的巢式PCR 是不需要酶切的，直接基因组DNA 扩增就行~
赞一下(1人) 回复此楼
繁花似錦，年華散盡。
4楼2010-08-14 20:16:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ben1147

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by Silencess at 2010-08-14 20:16:44:


啊·· 我之前做的巢式PCR 是不需要酶切的，直接基因组DNA 扩增就行~

TAIL-PCR可以扩增未知序列，又不用环化，可以直接扩增

简并引物序列都是现成的

但是感觉不如I-PCR成功率高，三轮PCR也麻烦一些
赞一下(2人) 回复此楼
6楼2010-08-14 22:06:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

linxi8579

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-08-14 14:03:01:
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长，自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了，肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧，至少五种以上

酶切充分一点，不 ...

做之前不是用Southern确定适当的酶切位点吗，选择环化后大小合适的位点。为什么要用多个内切酶。并且我想问一下这个反向PCR和Walking \RACE 有什么区别啊？多谢了。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2010-08-14 15:43:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Silencess

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-08-14 14:03:01:
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长，自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了，肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧，至少五种以上

酶切充分一点，不 ...

啊··   回收就是想避免 扩增环化片段过长吧··   

感觉环化好随机呀。。。 头疼
赞一下 回复此楼
繁花似錦，年華散盡。
5楼2010-08-14 20:19:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linxi8579

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by Silencess at 2010-08-14 20:16:44:


啊·· 我之前做的巢式PCR 是不需要酶切的，直接基因组DNA 扩增就行~

那么反向PCR与Walking 和RACE有什么区别啊？
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2010-08-16 11:27:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hnndpt

铁虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1楼: Originally posted by Silencess at 2010-08-14 13:57:07:
最近在做反向PCR··   
用的HaeIII酶切··  弥散性条带 回收800-2000bp 的片段，纯化，用2ng/ul 的量进行自环化。。但是之后的反向PCR  除了第一次跑出来一个，后面一直跑不出啊。。。

我想问··· 如果反 ...

请教楼主一个问题：环化后回收不到DNA,离心后看不到离心管里有东西啊，遇到过这样的现象吗？
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2011-08-15 22:12:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主 现在反向PCR做出来了没有呢？
赞一下 回复此楼
好好学习，天天向上
9楼2012-12-12 15:18:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangjiaxing1

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by ben1147 at 2010-08-14 22:06:05
TAIL-PCR可以扩增未知序列，又不用环化，可以直接扩增

简并引物序列都是现成的

但是感觉不如I-PCR成功率高，三轮PCR也麻烦一些...

请问，具体的TAIL-PCR步骤、引物怎么设计，之前也看过这方面资料，但是不是很懂，求教。
赞一下 回复此楼
10楼2013-09-12 10:09:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Silencess 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料调剂 +6 一样YWY 2026-04-05 6/300 2026-04-05 20:30 by 南航~万老师
[考研] 0703化学 +12 妮妮ninicgb 2026-04-04 13/650 2026-04-05 10:46 by 啊俊！
[考研] 求 +5 化工专硕323分 2026-04-04 5/250 2026-04-05 08:02 by 544594351
[考研] 一志愿郑大0705求调剂 +3 橘十一 2026-04-02 4/200 2026-04-05 00:05 by chongya
[考研] 求调剂 +4 晟功? 2026-04-03 4/200 2026-04-04 21:58 by hemengdong
[考研] 一志愿华北电力大学（北京），材料科学与工程学硕265，求调剂 +11 yelck 2026-04-03 12/600 2026-04-04 19:52 by dongzh2009
[考研] 求调剂 +3 ffyyu 2026-04-02 3/150 2026-04-04 19:03 by 蓝云思雨
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +6 崔wj 2026-04-02 6/300 2026-04-03 10:19 by 蓝云思雨
[考研] 一志愿a区211，085601-307分求调剂 +13 党嘉豪 2026-03-31 26/1300 2026-04-03 08:33 by 495374996
[考研] 一志愿华南师范大学-22408计算机-292分-求华南师范大学调剂 +4 爱读书的小鳄鱼 2026-04-02 4/200 2026-04-02 18:35 by 求调剂zz
[考研] 环境工程297分求调剂一志愿杭高院 +15 GENJIOW 2026-03-31 16/800 2026-04-02 17:56 by cyh—315
[考研] 一志愿郑大材料工程290求调剂 +20 Youth_ 2026-03-30 20/1000 2026-04-02 14:48 by 5896
[考研] 一志愿北京科技大学085601材料工程英一数二初试总分335求调剂 +8 双马尾痞老板2 2026-04-02 9/450 2026-04-02 14:45 by 5896
[考研] 一志愿北京科技大学材料学硕328分求调剂 +6 1段时间 2026-03-31 7/350 2026-04-02 13:57 by 3041
[考研] 材料求调剂 +10 呢呢妮妮 2026-04-01 13/650 2026-04-02 09:17 by olim
[考研] 材料调剂 +11 一样YWY 2026-03-31 11/550 2026-04-01 22:25 by zhouyuwinner
[考研] 合肥区域性重点一本招收调剂 +4 6266jl 2026-03-30 8/400 2026-03-31 18:43 by 6266jl
[考研] 080500-315分复试调剂 +9 上岸3821 2026-03-31 9/450 2026-03-31 17:29 by 唐沐儿
[考研] 一志愿中海洋材料357 +4 麦恩莉. 2026-03-30 4/200 2026-03-31 14:35 by 记事本2026
[考研] 材料专硕 085600求调剂 +7 BBQ233 2026-03-30 7/350 2026-03-30 17:44 by oooqiao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭