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Silencess

金虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】关于反向PCR 和测序结果的拼接已有6人参与

最近在做反向PCR··
用的HaeIII酶切·· 弥散性条带回收800-2000bp 的片段，纯化，用2ng/ul 的量进行自环化。。但是之后的反向PCR 除了第一次跑出来一个，后面一直跑不出啊。。。

我想问··· 如果反向PCR 的结果依然是弥散带，是不是可以反复调整下体系继续做呢？还是如果跑不出来就需要重新进行自环化？不知道大家反向的PCR 的成功率一般高么？有什么好的经验么？

还有就是反向PCR 测序的结果出来以后，应该如何拼接呢？如何找到片段的连接点？

求高人赐教·· 不甚感激！

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繁花似錦，年華散盡。

1楼 2010-08-14 13:57:07

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ben1147

木虫 (正式写手)

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★ ★ ★
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lstt09nk(金币+2):鼓励交流~~ 2010-08-14 15:44:08

反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长，自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了，肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧，至少五种以上

酶切充分一点，不用回收，产物直接纯化后稀释做连接

测序结果里面肯定有一个相应切点的，切点两边序列分别做反向互补，就分别是已知片段上、下游的序列

[ Last edited by ben1147 on 2010-8-14 at 14:04 ]