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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于反向PCR 和测序结果的拼接
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Silencess

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于反向PCR 和测序结果的拼接 已有6人参与

最近在做反向PCR··   
用的HaeIII酶切··  弥散性条带 回收800-2000bp 的片段，纯化，用2ng/ul 的量进行自环化。。但是之后的反向PCR  除了第一次跑出来一个，后面一直跑不出啊。。。

我想问··· 如果反向PCR 的结果依然是弥散带，是不是可以反复调整下体系继续做呢？ 还是如果跑不出来就需要重新进行自环化？ 不知道大家反向的PCR 的成功率一般高么？ 有什么好的经验么？

还有就是 反向PCR 测序的结果出来以后，应该如何拼接呢？ 如何找到片段的连接点？

求高人赐教·· 不甚感激！
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繁花似錦，年華散盡。
1楼 2010-08-14 13:57:07
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ben1147

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by wangjiaxing1 at 2013-09-12 10:09:05
请问，具体的TAIL-PCR步骤、引物怎么设计，之前也看过这方面资料，但是不是很懂，求教。...

上游简并引物一般是用四条或者六条，具体序列和扩增条件看原始文献（Liu, Y-G. Genomics, 1995, 25: 674-681; Liu, Y-G, Plant J., 1995, 8(3): 457-463）
下游引物在已知序列内部设计三条，依次靠近未知序列。
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11楼2013-09-13 10:15:53
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):鼓励交流~~ 2010-08-14 15:44:08
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长，自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了，肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧，至少五种以上

酶切充分一点，不用回收，产物直接纯化后稀释做连接

测序结果里面肯定有一个相应切点的，切点两边序列分别做反向互补，就分别是已知片段上、下游的序列

[ Last edited by ben1147 on 2010-8-14 at 14:04 ]
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2楼2010-08-14 14:03:01
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-08-14 14:03:01:
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长，自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了，肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧，至少五种以上

酶切充分一点，不 ...

做之前不是用Southern确定适当的酶切位点吗，选择环化后大小合适的位点。为什么要用多个内切酶。并且我想问一下这个反向PCR和Walking \RACE 有什么区别啊？多谢了。
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3楼2010-08-14 15:43:36
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Silencess

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-08-14 15:43:36:

做之前不是用Southern确定适当的酶切位点吗，选择环化后大小合适的位点。为什么要用多个内切酶。并且我想问一下这个反向PCR和Walking \RACE 有什么区别啊？多谢了。

啊·· 我之前做的巢式PCR 是不需要酶切的，直接基因组DNA 扩增就行~
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繁花似錦，年華散盡。
4楼2010-08-14 20:16:44
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