应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于反向PCR 和测序结果的拼接
52/1返回列表
查看: 2858  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

Silencess

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于反向PCR 和测序结果的拼接 已有6人参与

最近在做反向PCR··   
用的HaeIII酶切··  弥散性条带 回收800-2000bp 的片段，纯化，用2ng/ul 的量进行自环化。。但是之后的反向PCR  除了第一次跑出来一个，后面一直跑不出啊。。。

我想问··· 如果反向PCR 的结果依然是弥散带，是不是可以反复调整下体系继续做呢？ 还是如果跑不出来就需要重新进行自环化？ 不知道大家反向的PCR 的成功率一般高么？ 有什么好的经验么？

还有就是 反向PCR 测序的结果出来以后，应该如何拼接呢？ 如何找到片段的连接点？

求高人赐教·· 不甚感激！
回复此楼

» 猜你喜欢
繁花似錦，年華散盡。
1楼 2010-08-14 13:57:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ben1147

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by wangjiaxing1 at 2013-09-12 10:09:05
请问，具体的TAIL-PCR步骤、引物怎么设计，之前也看过这方面资料，但是不是很懂，求教。...

上游简并引物一般是用四条或者六条，具体序列和扩增条件看原始文献（Liu, Y-G. Genomics, 1995, 25: 674-681; Liu, Y-G, Plant J., 1995, 8(3): 457-463）
下游引物在已知序列内部设计三条，依次靠近未知序列。
赞一下 回复此楼
11楼2013-09-13 10:15:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):鼓励交流~~ 2010-08-14 15:44:08
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长，自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了，肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧，至少五种以上

酶切充分一点，不用回收，产物直接纯化后稀释做连接

测序结果里面肯定有一个相应切点的，切点两边序列分别做反向互补，就分别是已知片段上、下游的序列

[ Last edited by ben1147 on 2010-8-14 at 14:04 ]
赞一下(3人) 回复此楼
2楼2010-08-14 14:03:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linxi8579

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-08-14 14:03:01:
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长，自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了，肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧，至少五种以上

酶切充分一点，不 ...

做之前不是用Southern确定适当的酶切位点吗，选择环化后大小合适的位点。为什么要用多个内切酶。并且我想问一下这个反向PCR和Walking \RACE 有什么区别啊？多谢了。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2010-08-14 15:43:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Silencess

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-08-14 15:43:36:

做之前不是用Southern确定适当的酶切位点吗，选择环化后大小合适的位点。为什么要用多个内切酶。并且我想问一下这个反向PCR和Walking \RACE 有什么区别啊？多谢了。

啊·· 我之前做的巢式PCR 是不需要酶切的，直接基因组DNA 扩增就行~
赞一下(1人) 回复此楼
繁花似錦，年華散盡。
4楼2010-08-14 20:16:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭