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Silencess

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于反向PCR 和测序结果的拼接 已有6人参与

最近在做反向PCR··   
用的HaeIII酶切··  弥散性条带 回收800-2000bp 的片段,纯化,用2ng/ul 的量进行自环化。。但是之后的反向PCR  除了第一次跑出来一个,后面一直跑不出啊。。。

我想问··· 如果反向PCR 的结果依然是弥散带,是不是可以反复调整下体系继续做呢? 还是如果跑不出来就需要重新进行自环化? 不知道大家反向的PCR 的成功率一般高么? 有什么好的经验么?

还有就是 反向PCR 测序的结果出来以后,应该如何拼接呢? 如何找到片段的连接点?

求高人赐教·· 不甚感激!
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Silencess

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-08-14 14:03:01:
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长,自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了,肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧,至少五种以上

酶切充分一点,不 ...

啊··   回收就是想避免 扩增环化片段过长吧··   

感觉环化好随机呀。。。 头疼
繁花似錦,年華散盡。
5楼2010-08-14 20:19:02
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ben1147

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):鼓励交流~~ 2010-08-14 15:44:08
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长,自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了,肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧,至少五种以上

酶切充分一点,不用回收,产物直接纯化后稀释做连接

测序结果里面肯定有一个相应切点的,切点两边序列分别做反向互补,就分别是已知片段上、下游的序列

[ Last edited by ben1147 on 2010-8-14 at 14:04 ]
2楼2010-08-14 14:03:01
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linxi8579

铜虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-08-14 14:03:01:
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长,自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了,肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧,至少五种以上

酶切充分一点,不 ...

做之前不是用Southern确定适当的酶切位点吗,选择环化后大小合适的位点。为什么要用多个内切酶。并且我想问一下这个反向PCR和Walking \RACE 有什么区别啊?多谢了。
3楼2010-08-14 15:43:36
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Silencess

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-08-14 15:43:36:

做之前不是用Southern确定适当的酶切位点吗,选择环化后大小合适的位点。为什么要用多个内切酶。并且我想问一下这个反向PCR和Walking \RACE 有什么区别啊?多谢了。

啊·· 我之前做的巢式PCR 是不需要酶切的,直接基因组DNA 扩增就行~
繁花似錦,年華散盡。
4楼2010-08-14 20:16:44
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