24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 2523  |  回复: 10
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

Silencess

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于反向PCR 和测序结果的拼接 已有6人参与

最近在做反向PCR··   
用的HaeIII酶切··  弥散性条带 回收800-2000bp 的片段,纯化,用2ng/ul 的量进行自环化。。但是之后的反向PCR  除了第一次跑出来一个,后面一直跑不出啊。。。

我想问··· 如果反向PCR 的结果依然是弥散带,是不是可以反复调整下体系继续做呢? 还是如果跑不出来就需要重新进行自环化? 不知道大家反向的PCR 的成功率一般高么? 有什么好的经验么?

还有就是 反向PCR 测序的结果出来以后,应该如何拼接呢? 如何找到片段的连接点?

求高人赐教·· 不甚感激!
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

繁花似錦,年華散盡。
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hnndpt

铁虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
1楼: Originally posted by Silencess at 2010-08-14 13:57:07:
最近在做反向PCR··   
用的HaeIII酶切··  弥散性条带 回收800-2000bp 的片段,纯化,用2ng/ul 的量进行自环化。。但是之后的反向PCR  除了第一次跑出来一个,后面一直跑不出啊。。。

我想问··· 如果反 ...

请教楼主一个问题:环化后回收不到DNA,离心后看不到离心管里有东西啊,遇到过这样的现象吗?
8楼2011-08-15 22:12:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

ben1147

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):鼓励交流~~ 2010-08-14 15:44:08
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长,自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了,肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧,至少五种以上

酶切充分一点,不用回收,产物直接纯化后稀释做连接

测序结果里面肯定有一个相应切点的,切点两边序列分别做反向互补,就分别是已知片段上、下游的序列

[ Last edited by ben1147 on 2010-8-14 at 14:04 ]
2楼2010-08-14 14:03:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linxi8579

铜虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-08-14 14:03:01:
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长,自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了,肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧,至少五种以上

酶切充分一点,不 ...

做之前不是用Southern确定适当的酶切位点吗,选择环化后大小合适的位点。为什么要用多个内切酶。并且我想问一下这个反向PCR和Walking \RACE 有什么区别啊?多谢了。
3楼2010-08-14 15:43:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Silencess

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-08-14 15:43:36:

做之前不是用Southern确定适当的酶切位点吗,选择环化后大小合适的位点。为什么要用多个内切酶。并且我想问一下这个反向PCR和Walking \RACE 有什么区别啊?多谢了。

啊·· 我之前做的巢式PCR 是不需要酶切的,直接基因组DNA 扩增就行~
繁花似錦,年華散盡。
4楼2010-08-14 20:16:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 285求调剂 +5 mapmath 2026-04-06 6/300 2026-04-06 17:18 by 蓝云思雨
[考研] 一志愿武汉理工大学080200机械工程308分,求调剂 +4 终不似从前 2026-04-05 4/200 2026-04-06 11:46 by 考研学校招点人
[考研] 求助071001调剂!!! +4 黄守松 2026-04-05 5/250 2026-04-06 10:55 by 1028907439
[考研] 0817化学工程与技术求调剂,一志愿中海洋319 +14 lv945 2026-04-04 14/700 2026-04-06 10:20 by 蓝云思雨
[考研] 319求调剂 +3 handrui 2026-04-05 3/150 2026-04-06 09:33 by jp9609
[考研] 一志愿北京交通大学材料工程总分358求调剂 +4 cs0106 2026-04-04 4/200 2026-04-05 18:46 by imissbao
[考研] 一志愿华中农业大学0710(A)初试329分 求调剂 +4 一名26考研生 2026-04-04 4/200 2026-04-05 10:01 by barlinike
[考研] 283求调剂 +10 A child 2026-04-04 10/500 2026-04-05 08:22 by qlm5820
[考研] 296材料专硕求调剂 +21 202451007219 2026-04-02 22/1100 2026-04-04 21:48 by hemengdong
[考研] 求调剂 +6 朔朔话 2026-04-02 7/350 2026-04-04 19:16 by 蓝云思雨
[考研] 材料383求调剂 +5 郭阳阳阳成 2026-04-04 5/250 2026-04-04 19:06 by dongzh2009
[考研] 本科985,专业0812分336求调剂 +4 莫莫很行 2026-04-03 4/200 2026-04-03 21:31 by zhq0425
[考研] 材料与化工调剂一志愿大连海事085600,349 +11 吃的不少 2026-03-30 11/550 2026-04-03 18:05 by Jimmyandyou
[考研] 289-求调剂 +4 这里是_ 2026-04-03 4/200 2026-04-03 14:23 by 1753564080
[考研] 【求调剂】新能源材料本科,一志愿211,初试321 +6 求调剂学校, 2026-04-02 6/300 2026-04-02 09:41 by 晴空210210
[考研] 08生物与医药专硕初试346找调剂 +6 dianeeee 2026-04-01 7/350 2026-04-02 08:23 by guoweigw
[考研] 292求调剂 +17 木虫er12138 2026-04-01 17/850 2026-04-01 21:37 by 七度不信任
[考研] 284求调剂 +12 小熊~~ 2026-03-31 12/600 2026-04-01 20:23 by 花??
[考研] 318求调剂 +8 七忆77 2026-04-01 8/400 2026-04-01 10:37 by Jaylen.
[考研] 313求调剂 +6 卖个关子吧 2026-03-31 6/300 2026-03-31 10:58 by Jaylen.
信息提示
请填处理意见