应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于反向PCR 和测序结果的拼接
51/1返回列表
查看: 2459  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

Silencess

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于反向PCR 和测序结果的拼接 已有6人参与

最近在做反向PCR··   
用的HaeIII酶切··  弥散性条带 回收800-2000bp 的片段，纯化，用2ng/ul 的量进行自环化。。但是之后的反向PCR  除了第一次跑出来一个，后面一直跑不出啊。。。

我想问··· 如果反向PCR 的结果依然是弥散带，是不是可以反复调整下体系继续做呢？ 还是如果跑不出来就需要重新进行自环化？ 不知道大家反向的PCR 的成功率一般高么？ 有什么好的经验么？

还有就是 反向PCR 测序的结果出来以后，应该如何拼接呢？ 如何找到片段的连接点？

求高人赐教·· 不甚感激！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
繁花似錦，年華散盡。
1楼 2010-08-14 13:57:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hnndpt

铁虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1楼: Originally posted by Silencess at 2010-08-14 13:57:07:
最近在做反向PCR··   
用的HaeIII酶切··  弥散性条带 回收800-2000bp 的片段，纯化，用2ng/ul 的量进行自环化。。但是之后的反向PCR  除了第一次跑出来一个，后面一直跑不出啊。。。

我想问··· 如果反 ...

请教楼主一个问题：环化后回收不到DNA,离心后看不到离心管里有东西啊，遇到过这样的现象吗？
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2011-08-15 22:12:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):鼓励交流~~ 2010-08-14 15:44:08
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长，自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了，肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧，至少五种以上

酶切充分一点，不用回收，产物直接纯化后稀释做连接

测序结果里面肯定有一个相应切点的，切点两边序列分别做反向互补，就分别是已知片段上、下游的序列

[ Last edited by ben1147 on 2010-8-14 at 14:04 ]
赞一下(3人) 回复此楼
2楼2010-08-14 14:03:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linxi8579

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-08-14 14:03:01:
反向PCR只用一种酶不行啊

要是恰好相邻两个Hae III切点之间的片段太长，自连以后的片段长度就超出Taq的扩增能力了，肯定P不出来条带、弥散或者是非特异扩增

多用几种酶吧，至少五种以上

酶切充分一点，不 ...

做之前不是用Southern确定适当的酶切位点吗，选择环化后大小合适的位点。为什么要用多个内切酶。并且我想问一下这个反向PCR和Walking \RACE 有什么区别啊？多谢了。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2010-08-14 15:43:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Silencess

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-08-14 15:43:36:

做之前不是用Southern确定适当的酶切位点吗，选择环化后大小合适的位点。为什么要用多个内切酶。并且我想问一下这个反向PCR和Walking \RACE 有什么区别啊？多谢了。

啊·· 我之前做的巢式PCR 是不需要酶切的，直接基因组DNA 扩增就行~
赞一下(1人) 回复此楼
繁花似錦，年華散盡。
4楼2010-08-14 20:16:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 环境工程调剂 +6 大可digkids 2026-03-16 6/300 2026-03-16 17:16 by barlinike
[考研] 0703化学调剂 +6 妮妮ninicgb 2026-03-15 9/450 2026-03-16 16:40 by houyaoxu
[考研] 304求调剂 +3 曼殊2266 2026-03-14 3/150 2026-03-16 16:39 by houyaoxu
[考研] 344求调剂 +3 knight344 2026-03-16 3/150 2026-03-16 09:42 by 无际的草原
[考博] 欢迎申博同学联系 +3 天道酬勤2026686 2026-03-10 7/350 2026-03-15 19:03 by 天道酬勤2026686
[考研] 070305求调剂 +3 mlpqaz03 2026-03-14 4/200 2026-03-15 11:04 by peike
[考研] 材料专硕326求调剂 +4 墨煜姒莘 2026-03-15 4/200 2026-03-15 11:02 by dyw
[考研] 289求调剂 +5 步川酷紫123 2026-03-11 5/250 2026-03-15 00:45 by kruisytel
[基金申请] 现在如何回避去年的某一个专家，不知道名字 +3 zk200107 2026-03-12 6/300 2026-03-14 17:13 by zk200107
[考研] 267一志愿南京工业大学0817化工求调剂 +5 SUICHILD 2026-03-12 5/250 2026-03-14 14:53 by jean5056
[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自动化所实习 +3 Losir 2026-03-12 3/150 2026-03-14 12:11 by 热情沙漠
[考研] 307求调剂 +7 超级伊昂大王 2026-03-10 7/350 2026-03-14 00:49 by JourneyLucky
[考研] 调剂 +3 13853210211 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:47 by JourneyLucky
[考研] 招收0805（材料）调剂 +3 18595523086 2026-03-13 3/150 2026-03-14 00:33 by 123%、
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +6 邱gl 2026-03-12 7/350 2026-03-13 23:24 by 邱gl
[考研] 求调剂 +5 一定有学上- 2026-03-12 5/250 2026-03-13 18:31 by ms629
[考研] 293求调剂 +3 世界首富 2026-03-11 3/150 2026-03-13 16:27 by JourneyLucky
[考研] 085600材料与化工 309分请求调剂 +7 dtdxzxx 2026-03-12 8/400 2026-03-13 14:43 by jxchenghu
[考研] 哈工大材料324求调剂 +6 闫旭东 2026-03-10 8/400 2026-03-10 22:49 by 星空星月
[考研] 求调剂材料专硕293 +6 段_(:з」∠)_ 2026-03-10 6/300 2026-03-10 18:22 by ms629
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭