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芳芳在考研银虫 (小有名气)
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反向PCR遇到的问题 求大神大牛们的指点！
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反向pcr做了两个月，实验步骤，提基因组，酶切消化，T4连接，纯化产物，PCR，之前p出来都是糊带，最近发现T4连接后浓度就已经变得很低很低，几乎没有，纯化后就更少了。200微升连接体系。用的Sau3A1酶切，37度过夜，连接是16度，至少五个小时。十个小时的也连过，但是都是一样的浓度低。酶切的时候是取的10微升DNA去切，50微升体系，过夜后65度灭活20分钟，然后连接，取的是12.5微升酶切产物。 希望得到各位的指点，实验新手急需帮助啊！  |
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