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寻找好心人，帮帮我，关于引物以及PCR的问题！
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版主以及论坛内的各位高手快快现身吧，小弟实在被折磨的不行了，最近的实验相当不顺，PCR老是扩不出目的基因，不知道问题出在哪儿！5月19就要论文答辩了，过段时间还要去复试，时间太紧了！ RNA提取好之后直接反转录，用内参和设计的引物来PCR，内参可以扩出来，但是设计的引物却没有扩出条带，退火温度我用55度和50度都试了，但还是没有条带！现在感觉可能是我的引物有问题，但引物是老师帮我设计的，我也不知道是哪个模板！ 现在我的问题就是：我有引物的合成单，还有一段模板序列，但是不知道这个引物是不是以那个模板设计出来的，有没有什么办法可以检测下我的引物和模板能不能配对上啊，primer5.0可以吗？还望各位告知！ 引物：S1-4 GGCTCCCGCAAGTTAT A1 CCACCCACCCATACACT A2 CCACGCTTCACCCTACC A3 ACTGTCTGCCCACTCAC A4 GAGCACCGTTCCATACC 我说的模板序列为：CCACTTTTTTTTCCCCTTTCGCATCGCAATTGCGGNCNTGTCTTGCGTGTTCGCTGGCTGCACAAATTCTTCCCTCTCCGCGCGCCCCTAGAGAAAGCCGGCTCCCGCAAGTTATTAGGGAGTTGGTGTTACCGCCCGGGGGCCGACTGCAATGTTCTGTGTTGATCTGTCTCCCTCATCTTTTATAGTGGTGGCCCGCCGCGATGTTTGCTGATCACAGCCGGGATGCTGTTGGGGAGACTGAAAAGGAGGGAGAGTCGTCAAGCTAGGGGCATCCAAGAGAGGCAGCCTAACTTAGAGTTGCACGGTTCTGTGCGTGAGTGTATGGGTGGGTGGCTCGGTGGAGATACGCGCAGCAGCGGCGCGGGGAGGGGGGGGGAGGGGAAGCGAAGAGGCGGGGGCGGGTCGTGTGGATCGTTCAATGGGCATTAGCGCAGCGCAACTGGATACAATAGGAGGGCCGCGCTCTGTGGCAGGGGGGGGTGGGAGGCGAGCGGAGCGTGACACGTACAGGCTCTCCTAGGGTCGGCCAGCATCTGGGTGTGGGGCAGGAGCCTGGCAGTGAGTGGGCAGACAGTCGAGGTAGGGTGAAGCGTGGAGGCGAAGAAAAGGATGGGGCAAGCTGTATAAATGAACACGAGCGGCTAGGAAGTGGTGGGGAGTAGGTGTGTGGGGGTGTAGAGGGTGGGGAGAAAAAAAATTGGATTAGACGTGCGCACAATCCCGACGGTATGGAACGGTGCTCAGCGCG |
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 【分子生物】EPI帖 |
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hlwnxfd2011
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2楼2012-03-13 19:08:03
【答案】应助回帖
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小丹木木(金币+3, MolEPI+1): 很有用 2012-03-14 11:14:24
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小丹木木(金币+3, MolEPI+1): 很有用 2012-03-14 11:14:24
| "我有引物的合成单，还有一段模板序列，但是不知道这个引物是不是以那个模板设计出来的，有没有什么办法可以检测下我的引物和模板能不能配对上啊，primer5.0可以吗？还望各位告知！"关于楼主的这个问题你可以使用DNAMAN来解决自己找一下就是了，关于PCR扩增不出来你可以设置温度梯度从42到55不等，另外你也可以在前面加一个37度循环，另外呢，你可以用DNAMAN看一下你的引物，配对多吗，看一下是不是特别容易形成二聚体，根据这个你再做调整 |
3楼2012-03-14 09:10:15
dorecnu
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【答案】应助回帖
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xuzhu598(金币+20): ★★★★★最佳答案 2012-03-14 20:28:50
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 很热心哈 2012-03-14 22:19:24
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不要急，我慢慢回答你的问题： 1.模板长度为：751bp 2.S1-4 GGCTCCCGCAAGTTAT 位于模板正链100-115bp区段(16bp)；tm47℃ A1 CCACCCACCCATACACT位于模板互补链320-336区段（17bp）49.7℃ A2 CCACGCTTCACCCTACC位于模板互补链582-598区段(17bp) tm51.7℃ A3 ACTGTCTGCCCACTCAC位于模板互补链562-578(17bp)50℃ A4 GAGCACCGTTCCATACC位于模板互补链729-745(17bp)49.4℃ 就是说S1为正向引物F,其余为反向引物R.都能配对上。 3.以S1-4与A1为例，其TM值为47.6与49.7，有cross dimer但是能值很低，因该无影响，建议你降低退火温度至42-45度左右PCR。 4.引物较短，不知道是不是实验设计的特殊要求。 5.以上数据来源于primer 6，vectorNTI 10分析，这些软件就能解决你的问题，要毕业时实验还很忙一定要淡定，认真分析原因。 6.祝实验顺利，早日毕业。 |
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xuzhu5984楼2012-03-14 12:16:30
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